Immunophénotypage et étude des cellules

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1 Jeudi 20 novembre 2014 LEBLANC Romane L2 Relecture : Brassier Julia TSSIB Pr P. Robert 6 pages Immunophénotypage et étude des cellules Plan A. Introduction B. Phénotypage lymphocytaire C. Tests fonctionnels I. Isolation des lymphocytes et des monocytes II. Activation lymphocytaire III. Les phagocytes A. Introduction Quand explorer les lymphocytes? On a 2 situations pathologiques (défaut ou excès de fonction ) Défaut de fonction : déficits immunitaires acquis inné : Le système immunitaire n'est pas indispensable à la vie foetale, donc les fœtus peuvent être viables in utero puis à la naissance le déficit du système immunitaire est beaucoup plus grave car il ne peut pas se défendre contre les agents extérieurs Excès de fonction : auto-immunité (agression des Ag du soi) allergie (agression d'ag du non soi mais non dangereux, donc inflammation) Suivi thérapeutique : anticorps monoclonaux Au CHU : recherche Principe des explorations : Explorations phénotypiques Explorations fonctionnelles (assez compliqué, chères et travail sur cellules vivantes) Exploration génotypique B. Phénotypage lymphocytaire Le phénotypage peut se faire à partir du sang, ou d'autres liquides. On compte le nombre de T, B et NK. On peut ajouter des examens complémentaires afin de chercher les sous populations naïves et mémoires. On peut également réaliser une quantification des récepteurs membranaires car certains récepteurs sont spécifiques des populations leucocytaires. Position du problème : sur un frottis on peut distinguer un lymphocyte d'un monocyte par exemple, mais on ne peut pas distinguer un LT CD4 d'un LT CD8. On va donc rechercher les récepteurs membranaires car ils sont associés à la fonction. On va utiliser des anticorps monoclonaux fluorescents qui permettent de détecter ces récepteurs membranaires. Après avoir produit les anticorps, on peut distinguer chaque population et chaque sous population. 1/6

2 On peut donc distinguer les types cellulaires par leurs molécules membranaires qui elles-mêmes sont détectées par des anticorps monoclonaux marqués (par fluorescence). Le problème c'est que ce processus est assez long et cher surtout sur de grandes populations de leucocytes (car il faut analyser chaque cellule). On a aussi un problème de fréquence, le coefficient de variation est important, on ne peut pas détecter le nombre de cellules sur de faibles échantillons car la variation est trop importante. Sur deux échantillons différents de 100 cellules pris au hasard l'un aura plus de lymphocytes que l'autre, ou plus de monocytes du fait de la faible quantité de cellules dans l'échantillon. Il faut donc utiliser un automate qui fasse le travail à notre place On a donc créé le cytomètre de flux : détecte la passage de chaque cellule mesure l'expression de chaque marqueur (une couleur par marqueur) Aspects techniques : Dilution extrême des cellules : elles passent une par une devant le détecteur entouré de liquide de gaine, les cellules sont étirées ce qui facilite leur passage l'une après l'autre Excitation de la fluorescence par un laser (de longueur d'onde d'excitation des molécules de fluorescence des cellules). Chaque fois qu'une cellule passe devant le laser, la fluorescence est atténuée, car il y a de l'absorbance. On peut ainsi mesurer la fluorescence de chaque cellule. Détection de l'émission de fluorescence par : jeux de filtres colorés («tri» des couleurs) Photomultiplicateurs (détection de chaque couleur) Astuce de distinction des PN, monocytes et LT On représente les données sous formes de graphique. Chaque point correspond aux données d'une cellule. Sur le premier graphique (CD3 abscisse et CD8 ordonnée) : En bas à gauche on trouve les cellules NK car elles n'expriment pas CD3. En bas à droite il y a expression de CD3 il peut donc s'agir d'un LTCD4 ou d'un LTCD8, on voit aussi qu'il y a expression de CD4 donc c'est un LTCD4. En haut à droite il y a expression de CD8 et de CD3 donc c'est un LTCD8. LTCD8 et LTCD4 ont la même expression de CD3. 2/6

3 Sur le 2ème graphique (CD3 abscisse et CD19 ordonnée): En bas à gauche ce sont des NK car il n'y a pas de TCR donc pas de CD3 et il y a peu de CD19. En bas à droite il y a peu de CD19 et expression de CD3 en grande quantité donc c'est un LT (sans précision de quel type de LT). En haut à gauche c'est un LB car on trouve une grande quantité de CD19 Sur le 3ème graphique (CD3 abscisse et CD16/CD56 ordonnée) : En bas à gauche on trouve les LB car de nouveau faible expression de CD3 et de CD16/CD56. En bas à droite on trouve les LT car expression importante de CD3 mais faible de CD16/CD56. Enfin en haut à gauche, les NK car faible expression de CD3 mais forte expression de CD16/CD56 Les marqueurs usuels utilisés : CD45 : pan leucocytaire, important dans l'activité des T, est présent dans tous les leucocytes mais pas dans les hématies c'est donc un marqueur leucocytaire qui permet l'élimination des hématies CD3 : marqueur des LT, on rajoute CD4 ou CD8 pour déterminer le type de LT CD56+/-CD16 : marqueur des NK (car CD3 négatif) CD19 : marqueur des LB Si on trouve des anomalies en général on utilise des marqueurs supplémentaires. On a aussi des marqueurs spéciaux : CD25 (chaîne alpha du récepteur de IL2) : Quand le LT s'active il exprime le récepteur à IL2 (par transcription de la sous unité alpha) qui peut donc fixer IL2. CD25 est donc un marqueur de l'activation. En se fixant sur la chaîne alpha de l'il2, il montre que la cellule est activée CD45 : marqueur des cellules T naïves/mémoires. Exemple du syndrome de «Di George» caractérisé par des problèmes cardiaques important entraînant des problèmes de développement du thymus, le rapport cellules naïves/mémoires est très bas, il y a beaucoup plus de mémoires que de naïves. CD45 mémoire a une queue beaucoup plus longue que CD45 naïf. Clonalité des T ou des B : Si on reprend l'exemple du syndrome Di George, peu de LT fabriqués donc il y a peu de diversité, seulement quelques chaînes, V,J,D. Si on prend une vingtaine d'ac spécifiques on aura une vingtaine de chaînes V différentes. Si un patient fabrique des LT normaux, on aura seulement quelque % de V identiques, car il a une très grande diversité donc peu de versions d'un même V mais beaucoup de versions différentes. S'il ne fabrique pas des LT normaux, on aura de grands % de V car il y aura peu de type de V différents mais beaucoup de version d'un même V Tétramères C. Tests fonctionnels I. Isolation des lymphocytes et des monocytes 3/6

4 On ne peut pas travailler sur du sang car il y a trop d'hématies qui pourraient fausser les résultats, il faut séparer les lymphocytes des autres types cellulaires. On utilise donc un Gradient de centrifugation qui va permettre de séparer les cellules du fait de leur différence de densité. La densité des Lymphocytes est plus importante que celles des polynucléaires, hématies On fait couler le sang du patient sur un liquide de densité intermédiaire entre les hématies/polynucléaire et les lymphocytes/monocytes séparation des types de cellules. Les hématies vont au fond du tube (elles seront aspirées ensuite) et les lymphocytes/monocytes sont plutôt à la surface. On va donc pouvoir étudier les lymphocytes` II. Activation lymphocytaire 1) Prolifération But : Capacité des LT à être activés (la prolifération étant la prise de décision lymphocytaire finale) Méthode Recueil de PBMC (prélèvement sanguin périphérique de cellules mononuclées) Stimulation : Antigène : Les LT peuvent être activés par un antigène, il faut donc des CPA ce que sont les monocytes (présent dans l'échantillon). On rajoute donc un Ag (pour lequel le patient est immunisé), les monocytes vont donc le capter et le présenter aux LT, il le présentera donc au LT mémoire (puisqu'il est déjà immunisé) activation lymphocytaire Mitogènes : Un LT peut être activé par un mitogène (de manière non physiologique), on utilise de la phytolectine (d 'origine végétale) qui recrute tous les ligand présents proches du TCR ce qui va former des paquets de ligands. Ces derniers vont donc être phosphorylés par les kinases présentes sur le domaine cytosolique Activation des lymphocytes T non spécifiques, donc tous les LT seront activés sans spécificité et le signal sera très important Culture 4 jours (mitogènes) à 7 jours (antigènes) Décompte des cellules issues de mitoses, permettant d'observer la prolifération => Le système immunitaire entretient peu de copies du même LT mais une grande diversité de LT différents. On observe donc la prolifération des LT Méthodes de décompte des cellules : Radioactivité (incorporation de thymidine tritiée) : compte de la radioactivité Cytométrie de flux : Incorporation d'un marqueur cytoplasmique en début de culture (CFSE), mesure de la fluorescence moyenne, mesure de la fluorescence en fin de culture car les cellules présentes seront issues des mitoses à partir des cellules de bases et la fluorescence sera plus faible car elle diminue d'un facteur 2 à chaque génération cellules non dinisées (fluorescence initiale) 2) Synthèse de cytokines Méthode : Recueil des PBMC Culture avec stimulation et culture témoin 4/6

5 2 méthodes : On recueil des surnagent de culture que l'on dose par ELISA ELISPOT (détection directe dans la culture) On distingue les cellules qui produisent les cytokines 3) Fonction des LB On peut aussi détecter les LB par leur récepteurs : les BCR Ig. On dose les Ig III. Les phagocytes 1) La phagocytose Recueil des cellules On utilise des particules recouvertes d'opsonines (zymozan opsonisé ou microsphères) On décompte les cellules ayant phagocyté une particule Cette méthode peut être manuelle (microscopie en champs clair) Ou automatisée (cytométrie de flux) distinction adhésion/phagocytose 2) La bactéricidie Les phagocytes en plus de leur fonction de phagocytose ont une fonction de bactéricidie qui permet d'éliminer la bactérie. Lors de cette bactéricidie la cellule produit des dérivés réactifs de l'oxygène qui vont léser la cellule. On peut étudier ce phénomène par bactéricidie direct. Dérivés de l'oxygène : Synthèse d'anion superoxydes (O2-) : NADPH oxydase Synthèse d'h2o2 : superoxyde dismutase Peroxydase : OH+, HCl-, Hbr Colorimétrie Bactéricide directe : co-culture leucocytes/bactérie vivantes dénombrement à intervalle régulier des bactéries survivantes 3) Le chimiotactisme Les phagocytes produisent un gradient chimiotactiques. Substance : fmlf, C5a 5/6

6 Culture avec membrane perméable séparant 2 compartiments (chambre de Boyden) : les leucocytes se déplacent vers ce gradient chimiotactique car ils sont attirés, enfin on dénombre les cellules ayant migré 6/6