Manipulation des acides nucléiques

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1 Manipulation des acides nucléiques (voir chapitre 6 du Voet et Voet) - les acides nucléiques forment des polymères : ADN et ARN - ils sont composés de 4 nucléotides: A, C, G et T pour l ADN A, C, G et U pour l ARN - Propriétés physico-chimiques utilisées pour purifier les acides nucléiques; - polymères dont la taille varie avec le nombre de nucléotides - composés d une forte charge négative - adoptent une structure en double brins

2 Structure des acides nucléiques Figure 1

3 A. Solubilité et précipitation de l ADN - l ADN est très soluble dans l eau: - molécule très chargée - peu de groupements hydrophobes - Comme pour les protéines, sa solubilité variera avec les conditions salines et/ou la présence de substances organiques dans l eau - la précipitation à l éthanol est la façon habituelle de précipiter l ADN pour le concentrer ou changer son tampon cette approche est similaire à la précipitation des protéines avec des solvants organiques - la précipitation consiste en l ajout de 2.5 volumes d éthanol à une solution contenant de l ADN et 0.25M d acétate de sodium (pour éviter le séparation des double brins d ADN) - la solution est ensuite mise à -20 C pendant au moins 30 minutes et l ADN est récupéré par centrifugation à 10,000 rpm pendant 10 minutes à 4 C dans une microcentrifugeuse - une certaine quantité de sels sera aussi précipité avec l ADN. Des lavages subséquents avec de l éthanol permettra de les enlever. - autre solvants organique utilisé pour la précipitation: isopropanol

4 Extraction de l ADN au phénol - méthode de partition de phase dans laquelle les acides nucléiques sont retrouvés dans la phase aqueuse et les protéines, pour la plupart dénaturées, partitionnent dans le phénol, la phase plus dense, et à l interface des deux phases. - le ph du phénol doit d abord être ajusté à un ph Phase aqueuse Phase phénolique autour de 8 (l ADN est partiellement soluble dans le phénol acide) - agiter doucement 1 vol du phénol neutralisé avec 1 vol de la solution contenant de l ADN et extraire 2 fois - les traces résiduelles de phénol peuvent être éliminées par extraction avec du chloroforme immédiatement après - le chloroforme est éliminé facilement par après par précipitation avec de l éthanol - une centrifugation à faible force (5000xg) produit une séparation des phases et une interface plus nette - très fréquemment des protéases, telle que la protéinase K, sont utilisées pour dégrader les protéines et faciliter leur extraction au phénol

5 B. Électrophorèse de l ADN - puisque les acides nucléiques sont des molécules chargées (négativement), elles peuvent migrer dans un gel d électrophorèse, comme les protéines - à cause de leur grande taille, les acides nucléiques pénètrent difficilement dans les gels de polyacrylamide -> ces gels sont utilisés pour la purification ou l analyse d acides nucléiques de quelques centaines de nucléotides seulement - on utilise habituellement les gels d agarose pour purifier et analyser les acides nucléiques - ces gels, contenant de 0.5 à 2% d agarose, permettent de séparer des fragments d ADN de quelques centaines à plusieurs milliers de nucléotides - l agarose est dissous dans un tampon, puis bouilli. Lorsqu il refroidit, il polymérise spontanément (comme du Jell-O) et forme un gel (Figure 2). - l ADN est chargé dans les puits du gel et migrera vers l anode lors de l électrophorèse - on utilise un tampon contenant de l EDTA pour inhiber l activité des nucléases qui peuvent être présente dans la solution; le ph du tampon est autour de 8 - comme pour les protéines, la séparation s effectuera selon la masse moléculaire de l ADN, qui dépend de la taille des fragments d ADN: - fragment petits migrent plus rapidement que les plus grands

6 Coupe transversale d un gel d électrophorèse d agarose - l agarose non-polymérisé est coulé dans le moule (photo ci-dessous) pour prendre la forme voulue; le peigne (comb) permettra de créer les puits (wells) où seront chargé les échantillons d ADN Figure 2

7 Visualisation de l ADN dans le gel d électrophorèse - pour colorer les bandes d ADN dans les gels d électrophorèse, des colorants comme le bromure d éthidium sont utilisés - ce sont des molécules aromatiques cationiques planaires qui s intercalent entre les bases - lorsqu elles sont intercalées, elles fluorescent plus intensément qu à l état libre ATTENTION: Le bromure d éthidium est très cancérigène Figure 3

8 Gel d agarose A B A) Migration électrophorétique de fragments d ADN de tailles variables, avec un tampon Tris-acétate (TAE) ou Tris-borate (TBE). Sur chaque gel, les mêmes 5 échantillons ont été chargés à des temps différents B) Relation linéaire entre le logarithme du poids moléculaire de l ADN et de sa distance de migration. ( ) tampon TAE ( ) tampon TBE. Figure 4

9 C. Chromatographie des acides nucléiques - les mêmes techniques de chromatographies utilisées pour purifier les protéines sont aussi applicables pour la purification des acides nucléiques - chromatographie par échange d ions: puisque l ADN et l ARN sont de charge négative, un échangeur anionique sera utilisé. - Surtout utilisée pour purifier des oligonucléotides - filtration sur gel: surtout utilisée pour déssaler des oligonucléotides (de 10 à 100 nucléotides) - chromatographie d affinité: utilisé pour purifier les ARNm des cellules eucaryotes - ces ARN possèdent un queue de poly(a) à leur extrêmité 3 -> peuvent être purifiés sur une colonne d agarose à laquelle on a greffé une séquence de poly(u)

10 - Chromatographie sur hydroxyapatite - l hydroxyapatite (un sel de calcium) est utilisé pour purifier et fractionner l ADN par chromatographie - l ADN lie très fortement l hydroxyapatite, ce qui permet de le purifier rapidement d un lysat cellulaire - peut être élué grâce à un tampon riche en phosphate - l ADN simple brin éluera à une concentration plus faible en phosphate -> permet de séparer l ADN simple brin de l ADN double brin (Figure 5) Figure 5

11 D. Ultracentrifugation et purification de l ADN - une méthode couramment utilisée pour purifier et séparer l ADN est l ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium - la densité de flottaison de l ADN dans un tel gradient dépend de sa composition en bases selon l équation: ρ = 1, ,098X G+C - par exemple, cette technique permet de séparer l ADN nucléaire de l ADN mitochondrial ou chloroplastique - cette technique est aussi utilisée pour séparer les plasmides de l ADN chromosomal des bactéries Figure 6