Les techniques de détection et la recommandation (CE) 2013/99/UE

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1 Les techniques de détection et la recommandation (CE) 2013/99/UE Gilbert Berben, Olivier Fumière, Aline Marien Atelier «Détection de l origine des produits carnés par les tests ADN» Gembloux, le 31 mai 2013 EURL Animal Proteins in feedingstuffs. Walloon Agricultural Research Centre Agricultural Product Valorisation Department. Maurice Henseval Building. Chaussée de Namur 24. B-5030 GEMBLOUX (BELGIUM) Phone: +32 (0) Fax : +32 (0) secretary@eurl.craw.eu -

2 Techniques possibles En cas de contamination (mélange interespèces) d un produit carné d une espèce animale par une autre (ou de substitution même partielle), deux approches analytiques sont possibles : 1) La détection de protéines (ou de polypeptides) d une espèce animale donnée 2) La détection des acides nucléiques d une espèce animale donnée 1

3 Techniques ciblant les protéines Les principales méthodes sont l ELISA ou les tests en tigette. Ces méthodes utilisent des anticorps dirigés contre une partie d une protéine qui est spécifique par sa conformation à l espèce recherchée. Buvard Au Bande témoin Au Bande test Protéine Membrane Echantillon Au 2 Buvard

4 Techniques ciblant les protéines Il est en général impossible d utiliser le même test pour les produits crus et cuits (ou des produits contenant des protéines dénaturées). La limite de détection est rarement en-dessous de 0,5%. Requiert des kits commerciaux. 3

5 Techniques ciblant les acides nucléiques Méthodes indirectes ciblant des fragments d ADN spécifiques à l espèce. La méthode la plus courante est la PCR (réaction de polymérisation en chaîne). Applicable indifféremment sur produits crus et cuits (ou dénaturés). Très sensible (détection de < 0,1%). Technique plus indépendante des kits commerciaux. 4

6 La PCR Méthode la plus courante d amplification génique 5 Graphique de Ygonaar pour illustrer la PCR sur Wikipédia

7 La PCR en temps réel Par une série de techniques particulières, il est possible de suivre la cinétique de la réaction d amplification. Fluorescence Nombre de cycles

8 7 La PCR en temps réel

9 Test PCR en temps réel pour le cheval Amorce sens: 5 - CGA TCC CCT ATC AGC C - 3 Amorce antisens : 5 - TCC TTA GAT AGA TGG TGT TGG - 3 Sonde: 5 - TTC TGG TGT TGA CAA CAT GAC TAC TG - 3 Fluorochrome rapporteur : FAM (position 5 de la sonde) Flurochrome Quencher : TAMRA (position 3 de la sonde) La taille de la cible est de 87 bp et l origine de la cible est mitochondriale. 8

10 Protocole Publié sur le site web de l EURL-AP le 15/02/

11 Origine du test PCR Une cible PCR pour cétacés avait été développée pour une utilisation sur des farines de poisson L étude de sa spécificité avait montré une interaction avec le cheval. D où le fait qu une cible cheval avait alors été mise au point. 10

12 Spécificité Vérifiée contre 47 espèces animales avec entre autres: - Bos taurus (bovins) - Sus scrofa (porc) - Ovis aries (mouton) - Equus asinus (âne) - Capra hircus (chèvre) - Gallus gallus (poulet) - Meleagris gallopavo (dinde) pas d aspécificité 11

13 Spécificité (2) Vérifiée par rapport à 7 espèces végétales : - Glycine max (soja) - Zea mays (maïs) - Brassica napus (colza) - Triticum aestivum (froment) - Oryza sativa (riz) - Lycopersicon esculentum (tomate) - Beta vulgaris (betterave sucrière) pas d aspécificité 12

14 Sensibilité Echantillons C t C t Moyen Résultat 100 % viande de cheval 0.5 % viande de cheval % viande de boeuf 0.1 % viande de cheval % viande de boeuf 100 % boeuf

15 Robustesse Non testée au moment où le test avait été rendu public. Testé entre-temps d après le protocole allemand du 64 pour OGM aucun problème de robustesse pour une teneur de 0,1% (fraction en masse) 14

16 Recommandation 2013/99/EU Recommande la méthode PCR de l EURL-AP mais définit un seuil de 1% (en fraction de masse de viande de cheval dans la viande) Addendum requis pour le protocole L EURL-AP a également répondu aux nombreuses questions techniques des Etats membres 15

17 Addendum au protocole Méthode semi-quantitative développée en un laps de temps d une semaine: - Choix d une référence interne : un mélange de 1% de viande de cheval (muscle à broyer) dans du boeuf (muscle à broyer) - Sur base de cet extrait, on définit un cut-off (limite entre un résultat positif et un résultat négatif) : Ct moyen de la référence interne moins deux fois l écart type. Limite (en cycles) = Ct moyen 2 σ 16

18 Difficultés de la quantification - Fondamentalement la PCR mesure des nombres de copies d une cible relier cela à de la masse est généralement impossible - Une harmonisation tant sur les unités à employer, les méthodes d extraction et les tests par espèce est requise - Sur 1% l incertitude de mesure demeure acceptable (normalement < 50%) 17

19 Autres problèmes analogues - Aux Etats-Unis: 1/3 des produits à base de poisson est mal étiqueté (rapport du NSIL couvrant la période ) - En Chine : Fraude avec des rats et des renards vendus comme viande de bœuf (Le soir, 3 mai 2013) 18

20 Merci de votre attention!