Interprétation des résultats et troubleshooting

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1 Interprétation des résultats et troubleshooting Le Service de séquençage du Centre d innovation Génome Québec et Université McGill utilise des appareils 3730xl DNA Analyzer d Applied Biosystems. Cette technologie génère des séquences d au moins 800 pb avec un score de qualité supérieur à 60 à partir d échantillons de bonne qualité et qui respectent les concentrations recommandées. Ce document explique comment interpréter vos résultats de séquençage et comment résoudre les problèmes en cas de résultats non satisfaisants. Les problèmes observés, leurs causes possibles et les actions recommandées décrits plus bas visent à améliorer vos résultats de séquençage. Pas de séquence Observations Causes possibles Concentration et/ou qualité de l échantillon Interprétation des résultats et actions recommandées Quantifier l échantillon : Un excès d ADN peut inhiber la réaction de séquençage. Des concentrations trop basses donnent des séquences de piètre qualité. Les concentrations recommandées sont: Produits de PCR non-purifiés Produits de PCR purifiés Volume 20 μl minimum 7,5 μl minimum Concentration Les amplifications PCR doivent être vérifiées par migration sur gel d agarose et une copie de la photo du gel doit être envoyée au Service de séquençage avec les échantillons. Les produits de PCR de moins de 250 pb donnent des séquences de moindre qualité en raison d un phénomène de saturation (plus les fragments sont petits plus ils sont, en général, concentrés et plus le signal de la séquence obtenue est intense) et de compression des bases qui se produit au début et à la fin de toutes les séquences (phénomène relié à l électrophorèse en capillaires des séquenceurs 3730xl d ABI). Des produits de PCR de plus de 2000 pb pourraient être difficiles à séquencer, la concentration d ADN devenant un facteur limitant. En effet plus un produit de PCR est long plus sa concentration doit être élevée pour obtenir un résultat de séquençage satisfaisant.

2 ADN plasmidique ou phage Extrémités de BAC/PAC Volume Concentration 7,5 μl minimum ng/μl 20 μl minimum 500 ng/μl minimum Vérifier le ratio DO260/DO280: Un ratio entre 1.9 et 1.7 correspond à un ADN de bonne qualité. Un ratio de plus de 2 indique que l ADN est contaminé par des traces de chloroforme. Un ratio en dessous de 1.7 indique que l ADN est contaminé par des protéines. Les contaminations nuisent à la qualité des séquences. Purifier l échantillon. Concentration de l amorce, site de liaison non présent ou mauvaise amorce utilisée, amorce dégradée ou échec de l hybridation Quantifier l amorce : la concentration de l amorce doit être de 5 µm. Un excès d amorce ou une concentration trop basse donnent des séquences de piètre qualité. La qualité de l amorce est importante et elle peut dépendre du fournisseur. L amorce n a pas de site d hybridation sur l échantillon: essayer le séquençage avec une autre amorce qui possède une complémentarité avec l échantillon. Mauvais design de l amorce ou séquence de l amorce incorrecte : re-designer l amorce ou commander un nouveau tube. Le design de l amorce peut avoir un effet significatif sur la qualité des séquences, il

3 peut donc être nécessaire de designer de nouvelles amorces. Les recommandations suivantes devraient alors être prises en considération : La longueur de l amorce devrait être entre 18 et 24 bases. Le ratio G/C devrait être de 40 à 60%. La température d hybridation de l amorce doit être supérieure à 50 C. Éviter de designer des amorces en amont d homo ou hétéropolymères (répétitions de A, C, G ou T) car elles sont extrêmement difficile à séquencer. Noter que l amorce sens donne souvent de meilleurs résultats que l amorce antisens (ou vice versa). Ce problème ne vient pas du séquençage, mais il pourrait être relié à la température d hybridation, au contenu en GC, à la longueur de l amorce ou à la nature de la séquence en aval de l amorce. Essayer de séquencer dans les deux directions pour déterminer quelle est l amorce qui vous donnera les meilleurs résultats. Solution utilisée pour l élution de l ADN Éviter les solutions contenant de l EDTA pour resuspendre plasmides et produits de PCR extraits sur gel. L EDTA est un inhibiteur de la réaction de séquençage. Utiliser du Tris 10 mm ph 8 ou de l eau. Causes reliées au séquençage Pour toutes les causes reliées au séquençage : Réactif manquant, expiré ou incorrectement entreposé Échec du thermocyclage Perte des produits de la réaction de séquençage durant la précipitation Produits de la réaction de séquençage mal re-suspendu Capillaire bloqué Demander au Service de séquençage de répéter la réaction. Bonne séquence avec une mauvaise dénomination des bases Échec de l analyse Demander au Service de séquençage de ré-analyser la séquence. Séquence de faible intensité avec du bruit de fond Concentration de l échantillon insuffisante Quantifier l échantillon : des concentrations trop basses donnent des séquences de piètre qualité. Les concentrations recommandées sont indiquées en page 1.

4 Échantillon dégradé Préparer des échantillons frais pour un nouveau séquençage. Causes reliées au séquençage Pour toutes les causes reliées au séquençage : Réactif manquant, expiré ou incorrectement entreposé Échec du thermocyclage Perte des produits de la réaction de séquençage durant la précipitation Produits de la réaction de séquençage mal re-suspendu Capillaire bloqué Demander au Service de séquençage de répéter la réaction. Séquence présentant une saturation au début suivi d une baisse rapide de l intensité et de la qualité du signal. Échantillon trop concentré Quantifier l échantillon Les concentrations recommandées sont indiquées en page 1.

5 Signal saturé avec du bruit de fond d un court produit de PCR Échantillon de petite taille Les produits de PCR de moins de 250 pb donnent des séquences avec un score de qualité plus bas que la moyenne à cause du phénomène de saturation (plus les fragments sont petits plus ils sont concentrés et plus le signal obtenu est intense) et de la compression des bases qui se produit au début et à la fin de chaque séquence. Soumettez si possible des produits de PCR de plus de 250 pb. Demandez au Service de séquençage de ré-analyser les séquences pour diminuer le phénomène de saturation. Toutes les séquences de moins de 100 pb ont automatiquement le statut échoué dans notre application Nanuq. Demandez au Service de séquençage de changer la longueur seuil de la séquence dans les paramètres d analyse du projet. Homopolymères suivi d une séquence illisible Répétition de dinucléotides suivie d une séquence illisible Glissement de la polymérase sur la matrice d ADN pendant la réaction de séquençage à la suite d une région répétée Séquencer l échantillon dans les deux directions pour couvrir toute la séquence d intérêt. Le Service de séquençage peut tester à vos frais l ajout de bétaine à 1 M final à la réaction de séquençage, l utilisation de plus d enzyme et l augmentation du nombre de cycles d amplification afin d aider la polymérase à passer à travers la région de répétitions. Les répétitions de G sont particulièrement difficiles à séquencer. Séquence illisible après un poly G

6 La séquence stoppe après environ 200 pb Échantillon présentant une structure secondaire La présence d une structure secondaire dans l ADN produit une distorsion de la molécule qui empêche la polymérase de poursuivre l élongation lors de la réaction de séquençage. L enzyme se dissocie alors de l ADN. La séquence obtenue se termine brusquement. Le Service de séquençage peut tester à vos frais l utilisation du kit dgtp BigDye Terminator v3.0 d Applied Biosystems qui peut aider à séquencer les échantillons présentant une structure secondaire. Double séquence à partir d un point défini de la séquence du plasmide Contamination de l ADN La double séquence apparaît à partir du début de l insert. Ceci signifie que deux colonies bactériennes ont été prélevées lors de la mise en culture pour l extraction de l ADN. Faire une nouvelle extraction d ADN plasmidique à partir d une colonie bactérienne unique. Séquence double de produit de PCR Contamination de l ADN ou de l amorce S assurer que le produit de PCR contient une bande unique par migration sur un gel d agarose. La présence d une bande secondaire conduit à une séquence double. Si nécessaire, optimisez vos amplifications PCR par des conditions plus stringentes (augmenter la température d hybridation, diminuer la concentration en magnésium) Ou si nécessaire, utiliser un kit d extraction sur gel pour purifier la bande d intérêt. Le PCR n était pas complètement débarrassé des amorces. Le Service de séquençage peut essayer à vos frais de re-purifier le PCR pour éliminer l excès d amorces. S assurer que l amorce n est pas contaminée par une autre amorce. Retourner au tube d origine pour préparer une nouvelle aliquote ou commander

7 un nouveau tube d amorce. S assurer que l échantillon ne présente pas de sites de liaison multiples à l amorce. Si nécessaire, re-designer l amorce. S assurer que la température d hybridation de l amorce est supérieure à 50 C. Si nécessaire, re-designer l amorce. Signal avec du bruit de fond jusqu'à un point défini de la séquence Contamination du PCR de séquençage par du primerdimer S assurer qu il n y a pas de complémentarité dans la séquence des deux amorces utilisées pour l obtention des produits de PCR. Séquence de bonne qualité devenant double Échantillon avec insertion ou délétion Une insertion ou une délétion hétérozygote donne une séquence double. Séquencer l échantillon dans les deux directions permet de couvrir la séquence d intérêt dans sa totalité.

8 Séquence présentant un pic double Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Les polymorphismes résultent de l amplification d un ADN diploïde.

9 Une portion de la séquence est double Réarrangements de l ADN Des artéfacts de clonage pourraient être causés par : Des séquences instables comme les séquences répétées. Des structures secondaires fortes. Isoler et séquencer un autre clone. Début de la séquence retardé Capillaire bloqué Purifier l échantillon car l ADN contenant des quantités significatives de protéines ou de sels peut entraîner un retard du début de la séquence. Le Service de séquençage peut essayer à vos frais de purifier l échantillon par filtration et de répéter la réaction de séquençage. Superposition de hauts pics au début de la Causes reliées Ces pics correspondant aux ddntp marqués non-incorporés durant la réaction de

10 séquence au séquençage séquençage résultent d une purification post-séquençage insuffisante. Demander au Service de séquençage de répéter la réaction. Superposition de hauts pics dans la séquence Causes reliées au séquençage Demander au Service de séquençage de répéter la réaction. Séquence avec des pics larges de G Causes reliées au séquençage Altération de la fluorescence des bases marquées du kit de séquençage. Demander au Service de séquençage de répéter la réaction. Sequence with C secondary peaks Bases compressées au début de la séquence Causes reliées au séquençage Le début et la fin des séquences présentent une compression des pics qui nuit à la qualité de la séquence dans ces zones. Cette compression se produit lors de la migration des produits de réaction de séquençage dans les capillaires. Le système de détection du séquenceur ne parvient pas à séparer correctement les fragments les plus petits et les fragments les plus gros. Ceci conduit également à la perte des petits fragments de la réaction de séquençage. Les séquences que nous obtenons commencent de 40 à 100 pb

11 après l amorce. Ce problème est inhérent à la technique de séquençage utilisée. Pics mal définis en fin de séquence Le Service de séquençage vérifie la qualité de toutes les séquences. Si le séquençage a échoué sans raison évidente, la réaction sera répétée sur un nombre limité d échantillons pour un test sans frais. Les échecs dus à la nature de la séquence (exemples : répétitions, structures secondaires) ou à la piètre qualité des échantillons ou des l amorces sont de la responsabilité du client. Si le test montre que l échec du séquençage est du à un problème avec l équipement, le kit de séquençage ou une erreur humaine, les réactions seront répétées sans frais. Si vous avez des questions à propos de vos résultats n hésitez pas à contacter le Service de séquençage : Par courriel : sequencing.service@mail.mcgill.ca Par téléphone : #00522