3. Biotechnologie de l ADN

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1 3. Biotechnologie de l ADN 3.1. Technologie de l ADN recombinant Isolation d ADN et d ARN Fragmentation de l ADN (les Endonucléases) Analyse d ADN sur d agarose et d acrylamide Les vecteurs de clonage La ligation Transformations de bactéries Techniques d hybridation d acides nucléiques 3.2. Le séquencage 3.3. La réaction en chaîne en présence de polymérase (PCR)

2 Isolation d ADN et d ARN : Propriétés physico-chimiques des acides nucléiques Propriétés importantes pour l isolation et l étude des acides nucléiques Stabilité : Liaisons H = spécificité de l appariement des bases Interactions hydrophobes Solubilité : insolubles dans le phénol, les solutions salines et alcalines Précipités par l alcool et les solutions acides fortes En solution aqueuse, ils sont très acides Viscosité : ADN long et mince donc solution très visqueuse Densité : environ 1,7 g/cm 3, isolation possible sur gradient de césium Dénaturation : chimique par l urée ou le formamide thermique : ARN dénaturation progressive à la chaleur ADN dénaturation à une température précise (Tm) dépendant du contenu en G-C (propriété ayant permis la création de la PCR)

3 Isolation d ADN et d ARN : Propriétés physico-chimiques des acides nucléiques Propriétés importantes pour l isolation et l études des acides nucléiques Absorption UV : Les bases absorbent dans l UV avec un maximum à 260 nm Quantification : concentration déterminée par l absorption à 260 nm solution à 1mg/ml dans une cuve de 1 cm, A 260 =20 Pureté de l ADN : utilisation du rapport A 260 /A 280 Si A 260 /A 280 > 1,8 contamination par ARN Si A 260 /A 280 < 1,8 contamination par protéines

4 Isolation d ADN et d ARN -homogénéiser les cellules ou les tissus dans une solution de Guanidinium-thiocyanate/Phénol + SDS + Proteinase K -Ajout de chloroforme, mélanger vigoureusement -après centrifugation, les débris cellulaires se trouvent au fond du tube, les protéines dénaturées à l interface, l ADN et l ARN dans la phase aqueuse (supérieure) et les lipides en surface -prélever la phase aqueuse et précipiter les acides nucléiques à l éthanol Isolation d ARN : faire une extraction à ph acide; après centrifugation et séparation des phases seul l ARN reste en phase aqueuse, l ADN est présent soit à l interface, soit dans la phase organique. Continuer comme décrit ci-dessus.

5 Isolation d ADN et d ARN : l extraction Phénol/Chloroform La précipitation à l éthanol

6 Isolation d ADN et d ARN : Purification d ARNm par chromatographie d affinité sur oligo-dt Colonne oligo-dt ARNm purifié

7 Isolation d ADN et d ARN : Synthèse de l ADNc ADNc : molécule d ADN transcrite sur une molécule d ARNm + oligonucléotide polyt + transcriptase inverse + dntp + RNase H + ADN polymérase I + oligo (dt) + transcriptase inverse + RNase H + ADN polymérase Copie d ADN bicaténaire de l ARNm original

8 Fragmentation de l ADN : Les nucléases de restriction de la classe III - elles sont purifiées à partir des bactéries où leur rôle est de détruire tout ADN étranger (d un bactériophage ou d un virus p.e.) - elles reconnaissent une séquence spécifique de quatre à huit nucléotides, appelée site de restriction - elles hydrolysent les deux brins d ADN - elles sont des endonucléases, cad elles incisent dans le corps de la molécule - le génome de la bactérie est protégé du clivage par méthylation - différentes souches bactériennes contiennent des systèmes de restriction-modification différents

9 Fragmentation de l ADN : Séquence de reconnaissance de quatre enzymes de restriction - une séquence palindromique : production d extrémités franches (HpaI) - une coupure en zigzag cré des extrémités cohésives - 5 sortant pour EcoRI ou HindIII - 3 sortant pour PstI

10 Analyse d ADN : Principe de l électrophorèse

11 Analyse d ADN : Séparation des fragments d ADN Gel d agarose Gel d acrylamide Cathode + _ + + Anode Séparation d ADN bicatenaire de nt Séparation d ADN monocatenaire de nt La distance parcourue dans le gel par une molécule est inversement proportionnelle au logarithme de sa longueur.

12 Analyse d ADN : Exemple d électrophorèse

13 Expérience: Etablissez une carte de restriction

14 Expérience: Conclusion: Etablissez une carte de restriction

15 Les vecteurs de clonage Vecteur de clonage : élément génétique capable d autoréplication site multiple de clonage, MCS gène de résistance à l antibiotique, ampr Vecteur plasmidique 1,2-3,0 kb origine de réplication, ORI