MLVA Streptococcus pneumoniae

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1 H.I.A. Robert Picqué Bordeaux Laboratoire de Biologie moléculaire Version Internet 2 MLVA Streptococcus pneumoniae 1. DESCRIPTION DES OPERATIONS 1.1 Culture et extraction des ADN NB : prévoir dans la série l extraction de la souche R6 (= souche de référence) Les souches sont mises en culture sur gélose au sang de mouton et incubées 24 heures à 37 C sous CO 2. L extraction utilisée est une méthode rapide, elle associe un tampon de lyse à un choc thermique. Préparation du tampon de lyse : 100 ml 50 ml 25 ml Tampon TE ph 8 98,5 ml 49,25 ml 24,625 ml Triton 1 ml 0,5 ml 0,25 ml Tween 0,5 ml 0,25 ml 0,125 ml Il est préférable de préparer ce tampon la veille de son utilisation, car la mousse formée est longue à disparaître. Il est stable environ 6 mois. Aliquoter par 300 µl dans des microtubes à vis de 2 ml. Prélever quatre à cinq colonies identiques et les dissocier dans un tube de 2 ml contenant 300 µl de tampon de lyse. Vortexer. Incuber à 100 C 10 minutes. Vortexer. Incuber à 100 C 5 minutes. Laisser refroidir 5 minutes à température ambiante. Centrifuger 5 minutes à rpm, de manière à éliminer les débris cellulaires. Effectuer les PCR à partir du surnageant directement, ou diluer celui-ci au 1/10 ou au 1/100. Congeler l ADN à -20 C ou réfrigérer à + 4 C si utilisation immédiate. NB : le tampon de lyse peut être remplacé par une solution de NaCl à 9/1000. Dans ce cas le choc thermique doit être le suivant : Incuber à 4 C (dans la glace) 10 minutes 1

2 Incuber à 100 C 15 minutes. Vortexer. Incuber à 4 C (dans la glace) 10 minutes Incuber à 100 C 15 minutes Centrifuger 5 minutes à rpm, de manière à éliminer les débris cellulaires. Effectuer les PCR à partir du surnageant directement, ou diluer celui-ci au 1/10 ou au 1/100. Congeler l ADN à -20 C ou réfrigérer à + 4 C si utilisation immédiate. 1.2 Préparation des barrettes d ADN Exemple de barrette : souche1 souche2 Souche3 Souche4 Souche5 Souche6 Souche7 Souche8 Faire un plan des barrettes des ADN dilués. 3.3 Amplification des VNTRs par PCR On réalise une réaction de PCR pour chaque mini-satellite étudié. On effectue donc 17 réactions de PCR pour chaque souche. Les réactions de PCR se font dans un volume final de 20 µl Préparation du mélange réactionnel (MIX) (dans la pièce dédiée MIX): Utiliser des embouts stériles à filtres. Pour 1 échantillon : 1 échantillon Eau ultrapure 9,5 µl dntp (1,25 mm) 3,2 µl Amorce gauche (10 µm) 0,6 µl Amorce droite (10 µm) 0,6 µl Tampon 5X 4 µl GOTaq 0,1 µl Volume Total 18 µl 2

3 Distribuer 18µl de Mix dans chaque microtube (on utilise des barrettes de 8 microtubes) Distribution des ADN (dans la pièce dédiée extraction) : Ajouter 2 µl d ADN pour chaque échantillon et pour la souche R Programme PCR Dénaturation initiale 96 C 05m00s Dénaturation 96 C 00m30s Hybridation amorces 60 C 00m30s 30 Cycles Synthèse ADN 65 C 01m00s Extension finale 65 C 05m00s 4.4 Séparation des produits de PCR en gel d agarose Préparation des gels à 2 % d agarose Peser 7,5 g d agarose, Ajouter 375 ml de tampon TBE 0,5X (Tris Borate EDTA), Chauffer au four micro-ondes (environ 3min en agitant au moins une fois), Laisser refroidir. Sous une hotte à extraction chimique : Lorsqu il a atteint une température d environ 60 C à 65 C, ajouter 37,5 ml de bromure d éthidium (BET) sous une hotte à extraction chimique (port de gants nitrile obligatoire). Mélanger et couler le gel, Attendre environ une demi heure qu il polymérise Réalisation des dépôts : Si utilisation des peignes 26 puits déposer 5 µl des produits de PCR 3

4 Si utilisation des peignes 52 puits déposer 2 µl des produits de PCR Organiser les dépôts de la manière suivante : MCL Mu50 souche1 souche2 souche3 souche4 souche5 souche6 souche7 MCL (MCL marqueur de poids moléculaire) Migration : La migration est réalisée dans du tampon TBE 0,5X avec un voltage de 220V pendant 2 heures environ. Il peut être nécessaire d adapter le temps de migration, en fonction de la taille des motifs recherchés. Dépôts - sens de la migration Lecture des gels et interprétation Placer le gel sur la plaque UV, Prendre la photo. Déterminer la taille des fragments amplifiés, en les comparants au MCL et à la souche de référence R6. Pour chaque marqueur, le nombre d unités répétées est calculé à partir de la longueur totale du fragment amplifié selon la formule : Nb d unités = [taille du fragment amplifié taille des séquences flanquantes] / taille du motif Par exemple, pour le marqueur 1 (ms15_507bp_45bp_7u), le fragment amplifié a une taille de 507 pb pour la souche R6. Ce fragment contient 7 répétitions de 45 pb (soit 315 pb) ; par conséquent la taille des séquences flanquantes est : = 192 pb. Si pour une souche X vous obtenez un fragment amplifié de 417 pb, le nombre d unités sera donc : [ ] / 45 = 5 unités. 4

5 Dans certains cas, vous pouvez obtenir un nombre d unités non entier (par exemple 5,3 unités) ; par convention, le nombre d unités est arrondi au demi-motif (5,5 unités dans ce cas). Dans d autres cas, la taille du fragment amplifié est très importante, parfois supérieure à plusieurs milliers de pb. Ceci est souvent du à l insertion d un transposon dans la zone cible. Par convention, le nombre de marqueurs est dans ce cas fixé à 99. Une absence d amplification doit être vérifiée, si possible à l aide d un deuxième couple d amorces. Dans ce cas la valeur de l allèle est égale à zéro. En cas de problème technique (plusieurs bandes par exemple), la valeur -1 est attribuée. 5

6 2. REACTIFS Tampon TE : Tris Edta Buffer ph 8, flacon 500 ml SOCIETE SIGMA ALDRICH Référence catalogue : Prêt à l emploi, à conserver à +4 C. Triton : Triton X 100 for molecular biology, flacon de50 ml SOCIETE SIGMA ALDRICH Référence catalogue : T8787 Prêt à l emploi, à conserver à température ambiante. Tween 20 : Tween X 20, flacon de 500 ml SOCIETE PROCHILAB Référence catalogue : SR63158 Prêt à l emploi, à conserver à température ambiante. Eau ultrapure : Water Molecular Biology Grade SOCIETE DOMINIQUE DUTSCHER Référence catalogue : ml dntp : Set of 4 dntp SOCIETE PROMEGA Référence catalogue : U mm La solution de travail est à 1,25 mm. Amorces : EUROGENTEC Voir les séquences dans la description des marqueurs. 6

7 Les amorces sont livrées lyophilisées. La solution mère est à 100 µm. La solution de travail est à 10 µm. Taq polymérase : GoTaq DNA Polymerase SOCIETE PROMEGA Référence catalogue : M u (5 unités/µl) prêt à l emploi A conserver à 20 C Livrée avec le tampon : 5 x Green GoTaq Reaction Buffer Tube Eppendorf à 1 ml prêt à l emploi A conserver à 20 C Contient un tampon de charge pour la migration en gel d agarose. Agarose : SOCIETE PROMEGA Référence catalogue : V3125. flacon de 500 g Tampon TBE (TRIS BORATE EDTA BUFFER) 10X: SOCIETE SIGMA-ALDRICH Référence catalogue : T4415-L. flacon de 4 L Marqueur de poids moléculaire : Bio-Rad EZ load 100 pb ruleurs Référence catalogue : EZ load 20 pb ruleurs Référence catalogue :