Les instabilités protéiques des vins blancs : les mécanismes physico-chimiques Marie Dufrechou 13 octobre 2011

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1 Les instabilités protéiques des vins blancs : les mécanismes physicochimiques Marie Dufrechou 13 octobre 2011 Directrice de thèse : Aude Vernhet Codirectrice de thèse : Céline PoncetLegrand 1

2 Le vin : un milieu complexe Milieu hydroalcoolique (11/14%), ph acide (2,83,5), force ionique 0,01 à 0,1 M polysaccharides protéines polyphénols Composés colloïdaux Solutés: acides organiques, oligosaccharides, sels Protéines mg/l PRP (Pathogenesis Related Protein) Thaumatines (2024 kda) Chitinases (3035 kda) βglucanases (3741 kda) Protéines vacuolaires Invertase (66 kda) Chargées positivement phi 45 majoritairement Polysaccharides mg/l Mannoprotéines, RhamnoGalacturonanes de type II (RGII) ArabinoGalactanes Protéines (AGP) βglucanes Neutres ou chargés négativement 2

3 Contexte de l étude Formation de trouble au cours du transport ou du stockage des vins blancs et rosés Favorisée par des températures élevées Peut apparaître également pour des vins stockés dans de bonnes conditions (temp < 20 C) Protéines majoritairement impliquées dans le trouble 3

4 Contexte de l étude Test de stabilité : test à la chaleur (le plus fréquent) 80 C pdt 30 min Traitement de stabilisation Traitement de stabilisation Choix Bentonite de la dose de bentonite g/hl Dose en augmentation depuis les dernières décennies 4

5 Contexte de l étude Test de stabilité : test à la chaleur (le plus fréquent) 80 C pdt 30 min Avantages : simple et rapide Inconvénients : non spécifique Traitement de stabilisation Traitement de stabilisation Avantages Inconvénients Simple et efficace Traitement maîtrisé Matériau peu onéreux Perte des arômes et de couleur Perte de volume (3 % à 10 %) Rejets non recyclés 5

6 Conséquences Développement des tests/traitements alternatifs efficaces et spécifiques Identification de l origine exacte de ces troubles protéiques Meilleure compréhension de la nature des composés et des phénomènes physicochimiques impliqués dans la casse protéique 6

7 Etat de l art Les troubles protéiques dans les vins blancs Identification des protéines (SM et immunodétection) (Waters et al., 1996; Dambrouck et al., 2003) Identification des constituants et des mécanismes impliqués Utilisation de températures élevées (60 C 6 h, 80 C 0,5 à 2h) pour accélérer les phénomènes d agrégation Lien entre la composition en protéines du vin et sa sensibilité à la casse protéique pas de relation directe entre la composition du vin en protéines et sa stabilité études à différentes températures: les différentes classes de protéines présentent différentes sensibilités visàvis de l agrégation induite par la température (Hsu et Heatherbell, 1987; Sauvage et al., 2010) Impact de la matrice et des composés non protéiques sur la stabilité du vin impact des composés non protéiques (composés phénoliques, mannoprotéines, ions (Sarmento et al., 2000; Pocock et al., 2007; Dawes et al., 1994; Waters et al., 1994) impact du ph: des ph proches du PI favorisent l instabilité (Bayly et al, 1967; Batista et al., 2009) 7 7

8 Etat de l art Les troubles protéiques dans les vins blancs Très peu d études sur la stabilité colloïdale des vins à température ambiante (Esteruelas, M. et al Food Chemistry 2009; Pocock, K. F. 2006; Sarmento M.R. et al, 2000) Trouble naturel du vin à température ambiante très long à obtenir (> 12 mois) Présence dans les précipités de composés non protéiques (polysaccharides et polyphénols) Pas d étude sur les interactions physicochimiques impliquées à température ambiante dans la stabilité colloïdale des vins 8

9 Etat de l art Stabilité des protéines en solution interactions impliquant les protéines Agrégation des protéines en solution (Chi et al, 2003) intramoléculaires intermoléculaires dénaturation repliement Modifications de la conformation Stabilité de la conformation Agrégation Stabilité colloïdale Fortement influencées par la température, le ph et la force ionique du milieu 9

10 Etat de l art Stabilité des protéines en solution interactions impliquant les protéines Energy ΔG P (d) Forces de LondonVan der Waals (attractives et faibles) Interactions polaires (très influencées par la température) liaisons H solvant /composé Hydrophilic compounds Hydrophobic compounds (d) liaisons H entre groupements donneur et accepteur d hydrogènes entre composés 10

11 Energie ΔG E (d) Interactions électrostatiques (dépendent du ph et de la force ionique) Etat de l art Stabilité des protéines en solution interactions impliquant les protéines Charges similaires = répulsion Charges opposées = attraction Augmentation de la force ionique Charges similaires Charges opposées (d) 11

12 Objectifs de la thèse Meilleure compréhension de la nature des composés et des phénomènes physicochimiques impliqués dans la casse protéique Stabilité de la conformation des différentes protéines du vin en fonction des conditions physicochimiques et de la composition du milieu Impact des modifications de cette conformation sur leur agrégation Interactions physicochimiques susceptibles de se produire entre ces protéines, natives ou non, et d autres cosolutés tels que les polysaccharides et les polyphénols 12

13 Impact de la température sur le déroulement des casses protéiques impact sur les protéines impliquées cinétiques d agrégation caractéristiques des agrégats formés 13

14 Matériels et méthodes Analyse des protéines dans le vin de départ Sauvignon Standard Invertase KDa ß glucanase Chitinase Thaumatinlike Nombreuses isoformes présentes pi majoritairement entre 4 et 5,5 Protéines chargées positivement au ph du vin 14

15 Matériels et méthodes Démarches Cuvée mg/l de protéines ph 3,2 I = 0,02 M Chauffage pdt 2h suivi d un refroidissement Cinétiques d agrégation Témoin 30 C 40 C 50 C 60 C 70 C Dynamic Light Scattering(DLS) Centrifugation g pendant 30 min à 4 C Analyse des protéines du surnageant Culot Surnageant 15 1D SDS PAGE

16 Laser Matériels et méthodes Dynamic Light Scattering Détection et détermination de la taille de particules submicronique (macromolécules) intensité l, I 0 < I > Correlateur qq ms Echantillon Lumière diffusée(l, I) numérique PM ns. Référence (eau/ethanol) < I > angle Fluctuations d intensité détermination de la taille des particules 16

17 Intensité diffusée moyenne (I) Matériels et méthodes Dynamic Light Scattering : applications Diamètre hydrodynamique moyen (nm) diamètre hydrodynamique des agrégats/polymères dans un solvant donné stabilité/instabilité des systèmes colloïdaux en fct du solvant, de la temp, des cosolutés cinétiques d agrégation agrégation Séparation de phase agrégation Séparation de phase agrégation Dispersions métastables agrégation Dispersions métastables Systèmes stables Systèmes stables Temps (h) Temps(h) 17

18 Principaux résultats Impact de la température sur l agrégation 30 C 40 C 50 C 60 C 70 C Profils différents en fonction de la température, caractéristiques finales différentes des agrégats = Différents mécanismes existants suivant la température de chauffage Agrégats métastables 250 nm 18

19 Principaux résultats Répulsions électrostatiques Protéines sont des composés chargés est ce la stabilité à 60 C et 70 C est partie liée à des répulsions électrostatiques? Importance des répulsions électrostatiques dans la stabilité colloïdale Quelle est la place des liaisons H et des interactions hydrophobes? Ajout urée / SDS Suivi en DLS Chauffage 2h Refroidissement Concentration? Moment d ajout? 19

20 Principaux résultats Analyse des protéines du surnageant KDa Sauvignon Standard Invertase ß glucanase Chitinase Chauffage pendant 2 h C 20.1 Thaumatinlike 14.4 Différentes thermosensibilités des protéines du vin Isomorphes avec différents comportements 20

21 En résumé Mise en évidence de l importance des interactions électrostatiques dans la stabilité colloïdale Mise en évidence de la nécessité de considérer plusieurs températures de chauffage : 40 et 70 C 21

22 Stabilité colloïdale des vins blancs: effet combiné du ph, de la force ionique et de la température 22

23 Matériels et méthodes Démarche expérimentale 25 C (température ambiante, pas de dénaturation liée à la chaleur) 40 C (température intermédiaire, facilement atteinte lors du transport) 70 C (température élevée, test à la chaleur) ph : Force ionique : 0,02 M et 0,15 M 23

24 Principaux résultats A température ambiante (solutions modèles) : influence de la concentration Solutions très diluées avec des composés susceptibles d interagir = cinétiques lentes ph 3 0,15 M = systèmes cinétiquement stables g/l Existence de composés instables mais faible probabilité de rencontre Augmentation de l instabilité des systèmes avec l augmentation de la concentration en protéines 24

25 Principaux résultats A température ambiante (solutions modèles) : influence du ph 0,8 g/l 0,15 M Impact important des paramètres physicochimiques dans la gamme de ph du vin Augmentation de la stabilité ph Trouble Pas de trouble 25 Instabilité marquée à bas ph (loin du pi des protéines)

26 Principaux résultats A température ambiante: Systèmes modèles VS Systèmes réels Protéines purfiées à 0,8 g/l Systèmes modèles Perte des chitinases, thaumatinlike (2324 kda) et βglucanases Thaumatin 1920 kda et invertase stables Systèmes réels Membrane de dialyse Dénaturation induite par le ph agrégation Vin après 12 mois à T amb Concentration du vin x 5 à différents ph 26

27 Principaux résultats Impact de la température et du ph Stabilité conformationelle des protéines du vin visàvis de la température : étude par DSC ph = 3 ph = 4 T ms1 = 75 C T ms1 = 67 C 50 % de protéine dénaturée Décalage des températures de dénaturation des protéines en fonction du ph = protéines affectées différemment par la température suivant le ph 27

28 Intensity (kcounts/s) Principaux résultats Agrégation à températures intermédiaires 2h à 40 C (vin) Dh (nm) C 25 C 40 C 25 C ph 2.5 ph 3.0 ph 3.2 ph 3.5 ph Time (hours) ph 2.5 ph 3.0 ph 3.2 ph 3.5 ph 4.0 Dh = 500 nm Time (hours) Diminution de la stabilité Augmentation de la stabilité ph Pas de trouble Trouble Pas de trouble 28

29 Intensity (kcounts/s) Principaux résultats Agrégation à températures élevées 2h à 70 C (vin) Dh (nm) C 25 C 70 C 25 C ph 2.5 ph 3.0 ph 3.2 ph 3.5 ph ph 2.5 ph 3.0 ph 3.2 ph 3.5 ph Time (hours) Time (hours) Diminution de la stabilité ph Pas de trouble Trouble intense 29

30 Sauvignon Standard C 40 C 70 C Principaux résultats Protéines impliquées dans l agrégation KDa Protéines impliquées à ph 2,5 Bandes de 23 to 32 kda = chitinases TLPs βglucanases Protéines affectées de ph 2.5 à 3.5 Mêmes protéines qu à 25 C Quelques protéines stables à ph 2.5 (principalement TLP) A ph 4.0 toutes protéines précipitées Dénaturation induite par le ph agrégation Dénaturation induite par le ph et la chaleur Dénaturation de la plupart des protéines induite par la chaleur Phénomène de repliement à bas ph 30

31 Augmenation de la température Mécanismes d agrégation proposés 25 C ph 4.0 Diminution du ph, augmentation des répulsions électrostatiques ph 2.5 Protéines natives = pas d agrégation (pas de trouble) Dénaturation de quelques proteines induite par le ph cinétiques lentes Dénaturation des proteines avec une faible stabilité conformationnelle induite par le ph Instabilité colloïdale = formation d agrégats (Trouble) 40 C Dénaturation induite par la chaleur de quelques protéines Peu d agrégats Petite taille (Pas de trouble) Dénaturation induite par la chaleur et le ph de quelques protéines Agrégation entraîne la précipitation (Trouble) Dénaturation induite par la chaleur et le ph des protéines avec une faible stabilité conformationnelle Petits agrégats de taille finie (Pas de trouble) Dénaturation induite par la chaleur 70 C = Précipitation de toutes les protéines (Trouble intense) Agrégats de taille finie et protéines repliées (Trouble) 31 Agrégats de taille finie et protéines repliées (Pas de trouble)

32 Conclusion & Perspectives Mise en évidence d un effet couplé du ph, de la température et de la force ionique Importance des interactions électrostatiques dans la formation des agrégats Mise en évidence de différents isomorphes avec différents comportements visàvis de la température et du ph Une prise en compte de l impact du ph et de la force ionique du vin, associée à la composition en protéine pourrait permettre de rendre compte du comportement des vins blancs Validation de la dénaturation par le ph Préciser l influence des autres composés sur l agrégation, notamment des polysaccharides 32

33 Merci de votre attention Les instabilités protéiques des vins blancs : les mécanismes physicochimiques Marie Dufrechou 13 octobre