CH 14. Acides aminés Peptides et protéines

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1 C 14. Acides aminés Peptides et protéines

2 C 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PRTEINES 1. Acides aminés naturels Les protéines sont des assemblages macromoléculaires biologiques formés par enchaînement d'acides aminés.

3 1. Acides aminés naturels Naturels = issus des protéines. α Aminoacides R α C C Centre chiral

4 Les acides aminés naturels ont la configuration qui correspond au L-glycéraldéhyde : C C 2 N C C C 2 R L-glycéraldéhyde L aminoacide C C 2 N C = C R R

5 n dénombre 20 acides aminés naturels 12 sont synthétisés par l'organisme 8 sont issus de l'alimentation : les 8 acides aminés essentiels (soulignés dans les schémas). A. Les acides aminés alkylés C 2.35 C 2.35 C Glycine (Gly)G Alanine (Ala)A Valine (Val)V C Leucine (Leu)L C 9.76 Isoleucine (Ile)I 2.32

6 B. Les acides aminés aliphatiques avec alcools C Sérine (Ser)S C Threonine (Thr)T C. Les acides aminés soufrés C S Cystéine (Cys)C S C Méthionine (Met)M

7 D. Acide aminé hétérocyclique E. Acides aminés aromatiques C 1.95 N Proline (Pro)P C 2.16 C Phénylalanine (Phe)F Tyrosine (Tyr)Y C 2.43 N 9.44 Tryptophane (Trp)W

8 F. Aminodiacides et amides C C Acide aspartique (Asp)D 1.99 C C Acide glutamique (Glu)E 2 N C 8.84 Asparagine (Asn)N 2.10 C 2 N Glutamine (Gln)Q

9 G. Diaminoacides 2 N Lysine (Lys)K C N 1.82 C N Arginine (Arg)R 8.99 C N N 9.33 istidine (is)

10 C 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PRTEINES 1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base

11 En raison de la présence simultanée des deux fonctions acide et base, les acides aminés ont un comportement amphotère: l'état de la molécule va dépendre du p. R N 3 C - R N 3 C - - R C - p acide forme dipolaire (zwitterion) p basique

12 p R R N 3 C Ka 1 R C - N 3 R C - C - Ka 2 N 3 pka 2. p iso. pka 1. Equiv. base R C R N 3 C - N 3 R C -

13 Dans l'eau, quel que soit le p, les acides aminés sont des espèce chargées. n peut régler le p pour atteindre le point isoélectrique mais en aucun cas, les espèces ne sont exemptes de charges. Papier Papier p 9-10 et > p = point isoélectrique p 2-3 et < Ions négatifs Ions négatifs Point d'application Point d'application Ions positifs Ions positifs

14 Diacide aminé ou acide diaminé:!! à la séquence des pka Ex 1 : Acide aspartique 1) C proche de N 3 : pka 1 = ) autre C : pka 2 = ) N 3 : pka 3 = 9.82!!!!! Point isoélectrique : 3 C N 3 C - C pka 1 = 2.09 N 3 C - C N 3 C - - pka 2 = C N 3 C - N 3 C - - C - - C pka 3 = 9.82 N2 C -

15 Ex 2 : Lysine : 1) C : pka 1 = ) N 3 voisin : pka 2 = 9.2 3) autre N 3 : pka 3 = 10.8!!!!! Point isoélectrique : 10 3 N N 3 - C C - 3 N pka 1 = 2.18 N 3 C - 3 N - N 3 pka 2 = N - C N C - 2 N CpKa 3 = 10.8

16 Ex 3 : Arginine : 1) C : pka 1 = 1.8 2) N 3 : pka 2 = 9.0 3) Guanidinium : pka 3 = 12.5!!!!! Point isoélectrique : N N N 3 C - 2 N N C - pka 1 = 1.8 N 3 2 N N N 3 C - - pka 2 = N N - C 2 N N - C - 2 N pka 3 = 12.5 N N - C

17 Le groupe guanidine: plus basique que R (moins acide que RN 3 )... N.. C N C N N.. N. C.. N C 2. N.. N. C.. N C 2 Paire sp 2 Basicité accrue Résonance stabilisant le guanidinium... N N. C.. N C 2

18 C 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PRTEINES 1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides 3.1 Définition - Conventions

19 3.1 Définition - Conventions : Un peptide est une molécule constituée d'acides aminés enchaînés par un lien peptidique (amide). 3 N R' N C - Acide aminé N terminal Par convention, à gauche l'acide aminé N terminal et à droite l'acide C terminal : AAN-AA-AA-AAC Acide N terminal Acide C terminal R Lien peptidique Acide aminé C terminal

20 Ex : Glycyl-alanine Alanyl-glycine Gly-Ala Ala-Gly C 3 N C - 3 N N C - 3 N C 3!!!!! Complexité des enchaînements possibles!!!! Tripeptide constitué de Gly Ala et Val 6 possibilités Gly-Ala-Val Gly-Val-Ala Ala-Gly-Val Ala-Val-Gly Val-Ala-Gly Val-Gly-Ala (tétrapeptide 24 possibilités, pentapeptide 120, octapeptide )

21 C 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PRTEINES 1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides 3.1 Définition - Conventions 3.2 Composition et séquence des protéines

22 Une protéine est un polypeptide particulier de poids moléculaire élevé ( à ) et constitué à partir des 20 acides aminés (120 à 8000 par molécule) La structure primaire d'une protéine : quels sont les acides aminés? combien? quelle est la séquence?

23 3.2.1 Déterminer la composition L'hydrolyse complète de la protéine (par Cl- 2 6N à 110, 24 heures) fournit un mélange des acides aminés. Ces derniers sont analysés (par chromatographie à échange d'ions) : la chromatographie les sépare par passage à travers une colonne et "élution" par des mélanges tampons à p croissants (analyseur d'acides aminés). n enregistre, à la sortie de la colonne, la succession des acides aminés qui sont identifiés et dosés par comparaison avec des acides de référence.

24 ydrolysat Mélanges tampon à p croissant Identification et dosage Cl 6N Ninhydrine Détecteur 110 C 24 Le temps de séjour dans la colonne, caractéristique pour chaque acide aminé et fonction du p imposé, est le "temps de rétention"

25 Détection par la ninhydrine: Réaction spécifique de détection des acides aminés : la coloration violette apparaît pour toute solution qui contient un acide aminé à groupe primaire. 2 R N 3 C - N RC C violet -

26 Résine avant addition de l'échantillon Addition du mélange de Asp, Ser, Lys Elution du tampon 1 à p 3,25 Elution du tampon 2 à p 4,25 Elution du tampon 3 à p 5,25 Elution de Asp Elution de Ser Elution de Lys

27 3.2.2 Détermination de la séquence A. L'acide terminal est identifié par la réaction de SANGER : N 2 2 N F R N 2 N N R' 2 N N 2 N R N R' N Cl/ 2 2 N N 2 N R 2 N 2 N L'acide aminé N terminal est reconnu par son produit de condensation avec le réactif de Sanger et l'ensemble des produits est analysé par chromatographie. R' R"...

28 B. Dégradation d'edman : N C S Isothiocyanate de phényle (conditions basiques) S R N 2 N N R' R N N N N R' Peptide N S Cl/ 2 (conditions acides) N 2 N N R R' Peptide - acide N terminal N C S etc...

29 L'isothiocyanate se fixe sur l'acide N terminal du peptide en milieu basique, et après une réaction de cyclisation, se décroche en milieu acide, en formant une hydantoïne qu'on peut identifie par son temps de rétention sur une colonne de chromatographie. Le reste du peptide peut recommencer la réaction avec une nouvelle molécule d'isothiocyanate pour identifier l'acide aminé suivant. Cette opération est applicable environ 60 fois de suite et permet de déterminer la séquence de peptides courts.

30 C. Coupure sélective de liens peptidiques : Pour les peptides à longue chaîne, on fragmente en morceaux plus petits qui sont ensuite séquencés par d'autres méthodes (par exemple Edman). Les réactifs de fragmentation, parmi lesquels des enzymes appelés protéases, catalysent la rupture de la chaîne protéique en des endroits spécifiques.

31 Points de rupture: Chymotrypsine : le C de Tyr, Phe et Trp Trypsine : le C de Lys et Arg BrCN : le C de Met Carboxypeptidase : identifie le C terminal BrCN Chymotrypsine Ala-Ala-Lys-Cys-Met-Cys-Arg-Tyr-Ile-Phe-Gly-Trp-Ile-Pro Trypsine Carboxypeptidase

32 Exemple de détermination de séquence Un échantillon du peptide inconnu est d'abord hydrolysé totalement (Cl 6N, 110, 24 ) et par l'analyseur d'acides aminés fournit la composition suivante : 20 acides aminés Ala Arg Cys Glu Gly Leu Lys Phe Pro Thr Tyr Val

33 La chaîne totale (30 acides aminés) est séquençable par Edman. Pour cet exemple, nous procédons cependant à la fragmentation par la chymotrypsine: Chymotrypsine Phe 2 acides aminés isolés Peptide Tyr A B 3 peptides C A, B et C sont séquencés par la méthode d'edman: A = Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe B = Val-Cys-Ala-Leu-Tyr C = Thr-Pro-Lys-Ala La chymotrypsine ne coupe pas à droite de Ala: le fragment C est donc la séquence terminale. La carboxypeptidase confirme que Ala est bien l acide C terminal

34 Un nouvel échantillon du peptide initial est soumis au clivage par la trypsine et il en sort 3 fragments : Peptide Trypsine ????? - Thr-Pro-Lys-Ala C Ala D E (=Ala 30) puisqu'il est à droite de Lys 29 2 peptides D est séquencé par méhode d'edman et on trouve : D = Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys E = Val-Cys-Ala-Leu-Tyr-Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg Comme D se termine par Lys, il s'agit de Lys 29 et la comparaison des séquences de C et D permet de mieux préciser l'extrémité du peptide

35 La reconstitution de la séquence complète est aisément réalisée en partant du peptide porteur du C terminal et en cherchant les recouvrements des fragments. Val-Cys-Ala-Leu-Tyr Val-Cys-Ala-Leu-Tyr-Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe Phe Tyr Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys Ala Thr-Pro-Lys-Ala Chymotrypsine Val-Cys-Ala-Leu-Tyr-Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala Trypsine

36 C 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PRTEINES 1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides 3.1 Définition - Conventions 3.2 Composition et séquence des protéines 4. Synthèse des peptides 4.1 L'activation

37 4.1 L'activation Créer un lien peptidique c'est faire réagir la fonction amine d'un acide aminé avec le groupe carboxyle d'un autre. Un réactif activant ce couplage (DCC) est nécessaire: acide et amine ne réagissent pas spontanément pour donner un lien peptidique. R 1 C R 2 DCC dicyclohexylcarbodiimide N C N R 1 NC R 2 N C N dicyclohexylurée

38 C 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PRTEINES 1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides 3.1 Définition - Conventions 3.2 Composition et séquence des protéines 4. Synthèse des peptides 4.1 L'activation 4.2 La chémosélectivité:

39 4.2 La chémosélectivité: L'activation n'est pas suffisante pour construire un peptide: il faut associer les deux acides aminés dans un ordre précis. La double fonctionnalité pose le problème de la chémosélectivité. C C DCC R 1 C R 2 R 1 NC R 2 C R 2 NC R 1 C R 1 C R 2 NC R 1 NC R 2 tripeptides tétra... dicyclohexylurée

40 La chémosélectivité peut se résoudre par la protection des groupements dont on veut bloquer la réaction Réaction parasite Le problème R A B Q R C D La solution Réaction souhaitée n bloque la fonction A par un groupe protecteur P. R A B P R A B P Q R A D P R A D P Protection Réaction Déprotection

41 La protection N-Pam : (Pam = groupe protecteur de la fonction amine) Le groupe tboc: (t.butoxycarbonate) La fonction amino est transformée en fonction carbamate dont le groupe t.butyle sera éliminé, lors de la déprotection, sous forme d'isobutène. R N 3 C - R C N C dicarbonate de ditertiobutyle R C Cl C 3 C (déprotection) N 3 C 2 Produits gazeux

42 Mécanisme de déprotection : R N C C C 2 C C 3 C 3 R N C C R C 2 C

43 La protection C-Pac : (Pac = groupe protecteur de la fonction acide) La fonction acide est transformée en ester de méthyle, éthyle ou benzyle et la déprotection utilise la saponification R C - R C N 3 déprotection Na 2 R C -

44 C 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PRTEINES 1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides 3.1 Définition - Conventions 3.2 Composition et séquence des protéines 4. Synthèse des peptides 4.1 L'activation 4.2 La chémosélectivité: 4.3 Synthèse des peptides

45 4.3 Synthèse des peptides la protection des acides aminés En 3 étapes: R 1 C Pam R 1 C NPam R 2 C Pac R 2 CPac le couplage, avec activation, des dérivés protégés : R 1 C NPam la déprotection du peptide : R 2 CPac DCC R 1 CN NPam R 2 CPac R 1 CN CPac R 1 CN C NPam R 2 R 2

46 La technique : Synthèse sur support solide MERRIFIELD Un polymère contenant 1% de noyaux aromatiques chlorométhylés sert de point d'ancrage pour la synthèse réactifs Polymère C 2 Cl Produits P C 2 Cl

47 La synthèse : P C 2 Cl - C R 1 P C 2 C NPam déprotection R 1 Cl - NPam P C 2 C R 1 C R 2 couplage activé DCC NPam P C 2 C R 1 déprotection P C 2 C R 1 NC R 2 NC R 2 Br CF 3 C NPam R 2 R 1 P C 2 Br 2 N CN C

48 4.3.3 Un exemple complet: la synthèse du dipeptide Ala-Phe : Cette synthèse comporte 7 étapes. (La synthèse de la ribonucléase, enzyme de 124 acides aminés, demande 369 réactions et 6 semaines de travail).

49 Ala est l'acide N terminal et Phe est l'acide C terminal qui doit être accroché au polymère en premier lieu. N 3 C - Phe Phe-tBoc N C C P C 2 Cl C 2 Cl C 3 C N C P C 2 C P C 2 C Poly-Phe Poly-Phe-tBoc

50 Ala N 3 C - Poly-Phe N C Ala-tBoc P C 2 C C N C N N C N C N C N P C 2 C Poly-Phe-Ala-tBoc

51 N C Poly-Phe-Ala-tBoc N C P C 2 C Cl C 3 C Poly-Phe-Ala N C C 2 P C 2 C Br CF 3 C N 3 P C 2 Br N C Ala-Phe C

52 La chimie des groupes protecteurs demande : - de hauts rendements de protection et déprotection - la sélectivité de la protection : ne faire réagir que la fonction visée - la sélectivité de la déprotection : ne pas toucher au lien peptidique et éventuellement ne déprotéger qu'une fonction.

53 C 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PRTEINES 1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides 3.1 Définition - Conventions 3.2 Composition et séquence des protéines 4. Synthèse des peptides 4.1 L'activation 4.2 La chémosélectivité: 4.3 Synthèse des peptides 5. Structure des protéines: 5.1 Structure primaire

54 5.1 Structure primaire des protéines A la fin de la biosynthèse, les chaînes polypeptidiques subissent un reploiement en structures complexes qui créent des cavités dans lesquelles viendront se loger de petites molécules, par exemple des antigènes, s il s agit d anticorps, des substrats, s il s agit d enzymes. Cette structure dépend d abord de la séquence et de la composition (nombre et nature des acides aminés) de la protéine, c.à d. de sa structure primaire. Cette structure est obtenue par le séquençage de la protéine.

55 Le lien peptidique : R C N R' (-) R C () N R' La conjugaison donne au lien C-N un caractère de liaison double: C-N a une longueur de 1.32 Å dans le lien peptidique. C-N a une longueur de 1.47 Å normalement. 6 atomes sont dans le même plan, N et C sont sp 2.

56 Les liaisons hydrogène : N C C N Dans une même chaîne ou entre deux chaînes différentes, les liens hydrogènes créent rigidité et organisation de la protéine. Chaque lien apporte environ 5 Kcal de stabilisation.

57 Les liaisons disulfure : C N C N S S x. Red. S S C N C N Entre 2 cystéines de la chaîne polypeptidique, un lien disulfure peut former une boucle. Deux chaînes peuvent aussi s'accrocher par ce lien.

58 C 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PRTEINES 1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides 3.1 Définition - Conventions 3.2 Composition et séquence des protéines 4. Synthèse des peptides 4.1 L'activation 4.2 La chémosélectivité: 4.3 Synthèse des peptides 5. Structure des protéines: 5.1 Structure primaire 5.2 Structure secondaire

59 5.2 Structures secondaires des protéines Dans la forme reploiée, on trouve des structures régulières facilement reconnaissables : des hélices et des feuillets. n appelle celles-ci des structures secondaires.

60 élice α : Les hélices α sont caractérisées par : un pas de 5.4 Å 3,6 acides aminés par tour d'hélice en moyenne. Des liens hydrogène contribuent à cette structuration en hélice

61 Feuillets plissés β : Certaines protéines contiennent des éléments de structure en feuillets plissés, à nouveau ordonnés entre autre grâce à des liens hydrogène.

62 C 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PRTEINES 1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides 3.1 Définition - Conventions 3.2 Composition et séquence des protéines 4. Synthèse des peptides 4.1 L'activation 4.2 La chémosélectivité: 4.3 Synthèse des peptides 5. Structure des protéines: 5.1 Structure primaire 5.2 Structure secondaire 5.3 Structure tertiaire

63 5.3 Structure tertiaire des protéines Les protéines se présentent sous plusieurs aspects en raison de leur forme qui est réglée par les interactions de type liens ou S-S et par la solubilité et la polarité de leurs différentes zones. La répartition dans l espace de tous les atomes d une chaîne polypeptidique constitue sa structure tertiaire.

64 5.3.1 Protéines fibreuses (insolubles dans l'eau) Kératines (peau, cheveux, griffes) La kératine du cheveu est constituée de 3 hélices α juxtaposées et unies par des ponts disulfures La kératine des ongles a la même structure mais est plus riche en cystéine dans les hélices, donc avec plus de liens S-S et de rigidité. Collagène : tissus conjonctifs (cartilages, tendons, veines) Le collagène est constitué de 3 hélices entrelacées. Soies: (fibroïne des cocons) La soie est un empilement de feuillets plissés

65 5.3.2 Protéines globulaires (solubles dans l'eau et de forme à peu près sphériques). Les enzymes : catalyseurs biologiques spécifiques, comportant une cavité de forme particulière, le site actif. ormones peptidiques, telles que l'insuline et certains messagers chimiques peptidiques. Protéines de transport comme l'hémoglobine ou la myoglobine Protéines de stockage: Ex: caséine du lait ovalbumine du blanc d'oeuf ferritine

66 C 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PRTEINES 1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides 3.1 Définition - Conventions 3.2 Composition et séquence des protéines 4. Synthèse des peptides 4.1 L'activation 4.2 La chémosélectivité: 4.3 Synthèse des peptides 5. Structure des protéines: 5.1 Structure primaire 5.2 Structure secondaire 5.3 Structure tertiaire 5.4 Structure quaternaire

67 5.4 Structure quaternaire des protéines Ceci relève de l'agglomération de sous unités entre elles : l'hémoglobine est un agrégat de 4 polypeptides sphériques.