L ingénierie des protéines : approche prometteuse pour le développement de nouveaux antimicrobiens
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- Marc-Antoine Paquette
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1 L ingénierie des protéines : approche prometteuse pour le développement de nouveaux antimicrobiens Ismail Fliss et Riadh Hammami
2 Projet FQRNT-Équipe Équipe à l INAF: identification, caractérisation et étude de la relation structure/fonction des bactériocines de bactéries lactiques et des probiotiques. Équipe du centre de recherche du CHUQ, laboratoire de chimie médicale: synthèse chimique de peptides à activité biologique.
3 Objectif général Synthétiser à grande échelle, à partir des séquences peptidiques des bactériocines, de nouvelles molécules antimicrobiennes biologiquement actives, plus stables et ayant un large spectre d action. Microcine J25
4 Bactériocines? Peptides ou polypeptides produits naturellement par plusieurs souches bactériennes d origine alimentaire et environnementale. Activité antimicrobienne (bactéricide ou bactériostatique) dirigée contre des microorganismes phylogénétiquement proches de la souche productrice.
5 Bactériocines Phénomène très répandu (lactocoques et lactobacilles); Large spectre d activité antimicrobienne; Résistance à l acidité et aux traitements thermiques; 150 bactériocines de Gram (+) et 25 de Gram (-): BACTIBASE
6 Statut légal des bactériocines Nisine est la seule bactériocine acceptée dans plus de 50 pays. Carinobacterium maltaromaticum CB1: agent de bioconservation des produits de charcuteries(santé Canada, additif alimentaire) C. divergens M35: agent de bioconservation des produits marins fumés (Santé Canada, section des aliments nouveaux ) Pediococcus acidilactici: souche probiotique à usage vétérinaire (Santé Canada, section des produits de santé naturelle)
7 Applications Alimentaire: Agents de conservation des aliments( Nisine) Pharmaceutique: infections de la peau, germes multirésistants Vétérinaire: Traitement et prévention de la mammite bovine (WIPE OUT Immucell)
8 Avantages et limites Avantages Substances de grade alimentaire Complètement dégradées dans le tractus digestif Forte activité biologique: 10 3 à 10 6 fois supérieure aux autres antimicrobiens incluant les antibiotiques; Limites Spectre d action étroit l instabilité dans les matrices biologiques (protéases, de phs extrêmes, de sel). Faibles rendements de production (10%): difficulté de les produire à grande échelle, coûts élevés, etc Grande stabilité thermique: compatible avec divers traitements thermiques
9 Amélioration des rendements Approche microbiologique: sélection de souches fortement productrice (L. lactis diacetylatis UL719, P. acidilactici UL5), optimisation de procédés de fermentation (système avec cellules immobilisées), et de purification (immunoaffinité). Approche de biologie moléculaire: clonage et production de bactériocines recombinantes Approche d ingénierie des protéines: synthèse peptidique (connaissance parfaite des caractéristiques structurales et les liens avec l activité biologique)
10 Objectif général Élucider la relation entre les structures primaires et secondaires des bactériocines et leur fonction biologique. Le but ultime étant d exploiter les connaissances générées pour synthétiser à grande échelle, de nouvelles molécules antimicrobiennes biologiquement actives, plus stables et ayant un large spectre d action. Microcine J25
11 La microcine J25
12 La microcine J25 21 AA Structure unique en Lasso 3 feuillets β (5-7, et 18-20)
13 La microcine J25
14 Relation structure-fonction de la microcine J25 Plusieurs études de biologie moléculaire et de synthèse chimique ont tenté de produire la microcine J25 ou de dérivés actifs mais sans succès. Manque de connaissances sur la relation entre la structure particulière en Lasso de la microcine et de son activité biologique: - rôle de la boucle 1-8 en N-terminal, - rôle de la queue en C-terminal (avec ces deux segments : 9-17 et 18-21), - la présence de certains ponts amides (G1-E8 cyclisation), - La présence de certains AA particuliers.
15 La conformation globale particulière en lasso de la microcine est-elle indispensable à l activité biologique? J25 C1 GGAGH VPEYF VGIGT PISFYG CGAGH VPCYF VGIGT PISFYG C2 CGAGH VPEYF VGIGT PICFYG C3 GGAGH VPCYF VGIGT PICFYG C8 G1 C1 C8 C18
16 Structure tridimensionnelle des peptides dérivés de la microcine J25 J25 C1 C2 C3
17 La séquence complète de la microcine estelle essentielle à l activité biologique? J GGAGH VPEYF VGIGT PISFY G --YF VGIGT PISFY G -CYF VGIGT PICFY G 7-21 KCYF VGIGT PICFY G
18 Structure tridimensionnelle des peptides dérivés de la microcine J25 J
19 Est-ce que la charge globale nette influence l activité biologique de la microcine? J25 GGAGH VPEYF VGIGT PISFY G -1 WK_7-21 GWKGK WKCYF VGIGT PICFY G +3
20 Structure tridimensionnelle des peptides dérivés de la microcine J25 J25 WK-7-21
21 Liste des peptides synthétisés Peptide Sequence lien Masse (Da) Charge nette MccJ25 * GGAGHVPEYFVGIGTPISFYG C1 CGAGHVPCYFVGIGTPISFYG C2 CGAGHVPEYFVGIGTPICFYG C3 GGAGHVPCYFVGIGTPICFYG L GGAGHVPE C GGAGHVPEYF NC1 GGAGHVPCYF-GKG---CFYG NC2 GGAGHVPCYF-KKK---CFYG NC3 GGAGHVPCYF-WKW---CFYG L YFVGIGTPISFYG-NH C YFVGIGTPISFYG C CYFVGIGTPICFYG C KCYFVGIGTPICFYG WK_7-21 GWKGKWKCYFVGIGTPICFYG
22 Concentrations minimales inhibitrices (CMI) des peptides Souches CMI (µm) MccJ25 * NC1 NC2 NC3 C1 C3 8-21C 7-21C WK_7_21 Salmonella enterica subsp. enterica ATCC Salmonella enterica subsp. enterica ATCC Salmonella enterica subsp. enterica ATCC Salmonella enterica subsp. enterica ATCC Salmonella enterica subsp. enterica ATCC Salmonella enterica subsp. enterica ATCC Escherichia coli ATCC Escherichia coli ATCC Escherichia coli ATCC Escherichia coli O157 H7 ATCC Escherichia coli MC4100 ATCC Escherichia coli DH5a Escherichia coli LR > >250 >250 Listeria ivanovii HPB > >
23 Activité inhibitrice contre E. coli OD 595nm Concentration (µm) 7-21C-2S C1-2S C2-2S C3-2S-1 C3-2S-2 1-8L 8-21C-2S 9-21C-2S 9-21L 1-10C
24 Activité inhibitrice contre S. enterica ATCC Inhibition (%) MccJ25 C1 C3 NC3 8-21C 7-21C WK_7_ µm 7.8 µm
25 Activité inhibitrice contre Listeria ivanovii par les peptides actifs à250µm Densité optique (595nm) Control C1 7-21C WK_ Temps (Heures)
26 Potentiel électrostatique (Face A) Microcin J25 WK_7-21
27 Potentiel électrostatique (Face B) Microcin J25 WK_7-21
28 Structure secondaire expériences de dichroïsme circulaire : La structure secondaire des peptides actifs est très similaire à celle de la microcine J25 (structure en feuillet + coudes β)
29 CONCLUSIONS R1: oui, la structure en Lasso est importante mais non essentielle à l activité biologique de la microcine. R2: Non, la boucle joue un rôle important dans l activité antimicrobienne de la microcine (C1) mais sa délétion n abolit pas totalement l activité inhibitrice (7-21) R3: La substitution de certains acides aminés pour augmenter la charge globale semble améliorer l activité de la microcine et étendre son spectre d action pour le Gram+ (WK-7-21)
30 PERSPECTIVES Les nouvelles molécules peuvent être synthétisées à grande échelle avec des rendement élevés Ouvrent la porte à des applications de ces molécules dans plusieurs domaines (alimentaire, médical et vétérinaire) où la recherche de ces nouvelles molécules est de plus en plus urgente.
31 REMERCIEMENTS François Bédard Eric Biron Pedro Alvares Muriel Subirade Fond québécois de recherche sur la nature et les technologies (FQRNT-Équipe)
32 Bacteriocin Nisin Pediocin Lipid II Man-PTS Target recognition e.g. Sakacin Leakage of cellular content (ions, ATP) Translocation into the cytoplasm (e.g. colicins) Out Membrane Receptor Electrostatic interactions insertion and pore formation OR Destruction of membrane potential In Nucleolytic and related activities or Inhibition of protein synthesis
33 Peptides antimicrobiens: Mode d action général D une manière générale le mode d action se situe au niveau de la membrane : Attraction électrostatique Perturbation de la membrane Insertion bioénergétique et interaction
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