Rédacteurs : R. Guimbaud et J. Selves

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1 1 INFORMATION SUR L ORGANISATION REGIONALE DES TESTS MOLECULAIRES INDIQUES EN PRATIQUE CLINIQUE DANS LA PRISE EN CHARGE DES CANCERS COLORECTAUX 24 septembre 2008 Rédacteurs : R. Guimbaud et J. Selves 1. : TESTS RER 1.1 Pourquoi et pour qui? Le syndrome de Lynch (aussi nommé syndrome HNPCC : Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer) est un syndrome génétique héréditaire prédisposant aux cancers colorectaux (CCR) et aux cancers de l endomètre. Il est lié à l existence d une mutation constitutionnelle, dans le génome de l individu, sur l un des gènes de la famille MMR (gène MLH1 ou MSH2 ou MSH6 voire, très rarement, PMS2). Il est de transmission autosomique (non lié au sexe) et dominant (le risque de transmission est de 50 % pour chaque enfant). La pénétrance de la maladie (probabilité de voir apparaître la maladie lorsqu on est porteur du gène muté) est difficile à estimer mais vraisemblablement entre 50 et 70 % en ce qui concerne le risque de CCR et d environ 30 à 40 % en ce qui concerne le risque de cancer de l endomètre. Les risques relatifs d autres types de cancers peuvent aussi être augmentés : essentiellement voies urinaires (vessie exclue), intestin grêle, ovaires, estomac Sur le plan clinique, les tumeurs apparaissent souvent à un âge beaucoup plus jeune que l âge moyen des formes sporadiques dans la population générale ; néanmoins, le risque de CCR et d autres cancers associés persiste tout au long de la vie. Contrairement au syndrome de cancer héréditaire lié à la polypose adénomateuse familiale, il n y a pas de caractéristique clinique qui permet de reconnaître aisément un syndrome de Lynch, en dehors des cas où la présentation est caricaturale avec de très nombreux cas de CCR survenus à des âges très jeunes dans la même famille. Sur le plan tumoral, il existe des caractéristiques non pathognomoniques de syndrome HNPCC. En effet, les tumeurs colorectales développées dans le cadre d un syndrome de Lynch présentent un «phénotype RER positif» (RER pour Replicative ERror). Ce phénotype RER positif est le témoin indirect d une altération d un des gènes MMR. Deux types d analyses, différentes l une de l autre, caractérisent le» phénotype RER» : 1 la recherche d instabilité micro satellitaire 2 l extinction immunohistochimique des protéines M MR. Plus de 95 % des tumeurs colorectales développées dans le cadre d un syndrome HNPCC présentent un phénotype RER positif. Cependant, 15 % des tumeurs sporadiques présentent aussi un phénotype RER positif. Les mécanismes menant à ce phénotype RER positif sont alors différents de ceux impliqués dans le syndrome de Lynch. En effet, il s agit dans ce cas d une altération somatique (au niveau de la tumeur et non pas au niveau du génome de l individu) d un gène MMR le plus souvent le gène MLH1 (par hyperméthylation du promoteur de ce gène).

2 2 La prise en charge d une famille HNPCC va déboucher sur un conseil génétique permettant l application d un dépistage spécifique des apparentés à risque. Lorsque la mutation familiale est identifiée, l identification des apparentés concernés par le syndrome (porteurs de la mutation familiale) est aisée. Leur prise en charge par un dépistage adapté permet de réduire drastiquement la morbidité et la mortalité du syndrome. L identification du syndrome de Lynch est donc essentielle. Malheureusement, ce syndrome reste largement sous-diagnostiqué car la majorité des formes ne présente pas l ensemble des critères d «Amsterdam», c est-à-dire ne se présente pas sous une forme toujours caricaturale (au moins 3 cas de cancers colorectaux ou de l endomètre dans la famille, répartis sur deux générations, dont 1 survenu à moins de 50 ans). Il est donc essentiel de diagnostiquer les syndromes de Lynch avant qu ils ne se présentent sous une forme caricaturale ayant entraîné une forte morbidité et/ou mortalité dans la famille. La stratégie de dépistage des syndromes de Lynch repose sur le screening tumoral des patients présentant un CCR à moins 60 ans et des patients présentant un CCR quel que soit leur âge mais avec un antécédent personnel, ou familial au premier degré, de cancer du spectre étroit du syndrome de Lynch (CCR, cancer de l endomètre, voire cancer des voies urinaires / vessie exclue et cancer de l intestin grêle). Dans cette population, représentant environ 20 % de l ensemble des cancers colorectaux, un test RER doit être réalisé. Lorsque le test RER est négatif, un syndrome HNPCC peut a priori être exclu et la démarche s arrête là. En revanche, lorsqu un test RER est positif, la situation est alors compatible avec un syndrome HNPCC (mais non spécifique puisque l on sait que 15 % des cancers sporadiques présentent aussi un phénotype RER positif) : il est alors nécessaire d approfondir la démarche oncogénétique. L étape suivante sera la réalisation d une consultation d oncogénétique pour, entre autre, la recherche de la mutation constitutionnelle qui permettrait d affirmer l existence du syndrome si elle était présente. Au total, il est donc indiqué que soit réalisé un test RER chez : - 1/ tout sujet présentant un cancer colorectal à 60 ans ou moins de 60 ans - 2/ tout sujet présentant un cancer colorectal avec un antécédent personnel ou familial au premier degré de cancer colorectal ou de cancer de l endomètre ou de cancer de l intestin grêle ou de cancer urothélial (vessie exclue). Parmi eux, les patients dont le test RER s avère positif devront avoir un avis oncogénétique spécialisé. Pour les cas où le syndrome de Lynch semble évident (présence des critères d «Amsterdam») ou pour les cas de forme de cancers colorectaux juvéniles ( 40 ans), le test RER peut bien sûr être demandé, mais il existe une indication de consultation d oncogénétique systématique. Bien sûr, toute autre situation «étonnante» sur le plan clinique, mais ne rentrant pas dans ces critères, peut aussi faire appel à un avis oncogénétique.

3 3 1.2 Comment et où? Le «phénotype RER» peut être évalué par deux types d analyses : d une part, la recherche d instabilité micro satellitaire, d autre part, l étude immunohistochimique de l expression des protéines MMR : instabilité micro satellitaire Les microsatellites sont des séquences ADN du génome mono, di, tri nucléotidiques, répétées en tandem (exemple : CACACA ). A l échelle de la population, il existe des séquences microsatellites monomorphes (un seul allèle pour l ensemble de la population) et des séquences microsatellites polymorphes (plusieurs allèles au sein de la population). A l échelle individuelle, un microsatellite peut être homozygote (les 2 allèles du locus sont identiques) ou hétérozygote (2 allèles différents pour le même locus). Ces séquences microsatellites sont fréquemment le siège d erreurs lors de la réplication de l ADN : les mésappariements y sont fréquents, ces séquences nucléotidiques en tandem favorisant le glissement de l ADN polymérase. Lors du fonctionnement cellulaire normal, ces erreurs de mésappariement sont réparées grâce aux protéines issues des gènes MMR (MMR : Mismatch Repair) : MLH1, MSH2, MSH6 et PMS2. On comprend donc bien que lorsqu il existe une altération des gènes MMR, il y ait une perte de fonction des protéines codées par ces gènes et par voie de conséquence, un dysfonctionnement entraînant une non-réparation des erreurs de mésappariement et donc une accumulation de ces erreurs C est donc au niveau de séquences micro-satellitaires que se détectent particulièrement bien les erreurs de réparation liées à un dysfonctionnement des protéines MMR sous forme d allèles supplémentaires dans l ADN tumoral : c est ce que l on appelle l instabilité microsatellitaire (IMS) Le dysfonctionnement des protéines MMR peut être lié soit à une altération d un gène au niveau constitutionnel (c est le cas dans le syndrome HNPCC avec des mutations constitutionnelles de gènes MMR), soit à une altération génique au niveau tumoral somatique. Dans ce dernier cas, il s agit d une perte de fonction de MLH1 et le mécanisme le plus souvent impliqué est sa répression épigénétique par hyperméthylation de son promoteur (phénomène observé dans la majorité des 15 % de cancers sporadiques présentant un phénotype RER positif). La recherche d IMS des tumeurs colorectales se fait en 3 étapes : - 1) Extraction de l ADN, - 2) Amplification par PCR de séquences micro satellitaires (en général 5 micro satellites), - 3) Génotypage de ces micro satellites. La méthode de référence, datant de 1998, imposait l examen de 5 séquences micro satellitaires de l ADN tumoral et la comparaison de ces séquences à celles de l ADN normal. L IMS était alors affirmée devant l existence d au moins 2 marqueurs instables. Depuis 2003, les séquences micro satellitaires choisies sont des micro-satellites monomorphes dans la population, il n y a donc pas nécessité de comparer à de l ADN normal et l étude de l IMS peut se faire uniquement à partir de l ADN tumoral. La définition de l instabilité reste identique avec au moins 2 microsatellites instables sur 5 analysés : Immuno-Histochimie L étude immuno-histo-chimique (IHC) de l expression des protéines MLH1, MSH2, MSH6 et PMS2 est réalisable.

4 4 La perte d expression d une de ces protéines peut traduire une mutation du gène correspondant (la mutation menant à l absence de synthèse de la protéine ou la synthèse d une protéine tronquée non reconnue par l Ac utilisé en IHC). Cette perte d expression caractérise alors un phénotype RER positif. Une extinction protéique de MSH2 et/ou MSH6 est spécifique d un syndrome de Lynch ; en revanche une extinction de MLH1 peut être liée à un syndrome de Lynch ou à un CCR sporadique (15% des CCR sporadiques) : Caractéristiques et choix entre IMS et IHC L IMS : Elle est le «gold standard» pour l affirmation d un phénotype RER : elle traduit en effet directement la perte de la fonction de réparation. En outre, c est une méthode standardisée et reproductible. Elle repose sur l étude de l ADN tumoral et nécessite donc son extraction ; elle nécessite la mise en œuvre de techniques de biologie moléculaire et est incompatible avec des fixateurs acides n ayant pas permis une conservation de l ADN. L IHC : Elle est, en théorie facile et peu coûteuse, mais surtout disponible dans tous les laboratoires d anatomie pathologique. Elle cible un gène précis (et permettra ensuite de centrer l analyse constitutionnelle sur ce gène). Sa sensibilité semble équivalente à la recherche d IMS, mais sa performance dépend du fixateur (il faut préférer le formol) et elle nécessite d être interprétée par un lecteur entraîné. Elle peut poser le problème de quelques faux négatifs (maintien de l expression d une protéine, bien qu il s agisse d une protéine non fonctionnelle). Cette étude ne peut être réalisée que sur tumeur fixée et incluse en paraffine. Idéalement, on réalise conjointement, pour l analyse du phénotype RER : la recherche d IMS et l étude IHC de l expression des protéines MMR Tests moléculaires complémentaires : Pour information, d autres tests moléculaires peuvent être réalisés sur indication oncogénétique : - Recherche de la Mutation BRAF V600 E : Cette mutation somatique est présente dans 50 à 70 % des CCR sporadiques, mais n est pas présente dans les CCR liés à un syndrome de Lynch. Cette recherche de mutation est donc utile dans le cadre de l analyse des tumeurs colorectales présentant un phénotype RER positif potentiellement sporadiques (c est à dire avec extinction IHC de la protéine MLH1). La recherche de mutation BRAF V600 E, si elle est présente, permet alors de retenir le diagnostic de CCR sporadique de phénotype RER + et d écarter celui de Sd de Lynch. - Etude de la méthylation MLH1 : Cette approche parait la plus attrayante pour identifier les tumeurs sporadiques RER positive avec extinction IHC de la protéine MLH1. L hyperméthylation du gène MLH1 est en effet le mécanisme de l IMS des cancers sporadiques et n est en général pas observé dans les Sd de Lynch. Cependant les méthodes d analyse de la méthylation ne sont pas encore à ce jour suffisamment standardisées pour être utilisées en routine et leur interprétation reste souvent délicate.

5 5 En pratique en Midi-Pyrénées : Où est fait le test RER? : Dans le laboratoire d anatomo-pathologie du CHU de Toulouse / Purpan (Pr Brousset) dans le cadre de la plateforme hospitalière de génétique moléculaire des cancers de Midi-Pyrénées labellisée par l INCa (resp. E. Delabesse). Comment? : - Sur un bloc de tumeur fixée ou congelée - Par immuno-histochimie +/- génotypage des microsatellites - Les autres tests, plus spécialisés (recherche de mutation somatique BRAF ou étude de la méthylation de MLH1), relèvent d indication oncogénétique spécialisée. 2. : RECHERCHE DE MUTATION k-ras Pourquoi et pour qui? Voie EGF-R et k-ras : L implication de la voie EGF-R dans le processus tumoral des cancers, notamment colorectaux, a été mise en évidence depuis quelques années. Très schématiquement, l EGF se fixe sur le récepteur à l EGF (EGFR), récepteur de type «tyrosine kinase». La fixation du ligand à son récepteur entraîne alors une phosphorylation du récepteur et une cascade d événements transductionnels en aval permettant, in fine, la transcription de gènes impliqués dans la prolifération tumorale, le processus métastatique, l angiogenèse Ces cascades transductionnelles impliquent notamment la protéine RAS qui est ellemême activée lors de l activation du récepteur EGF par son ligand. La voie EGFR est devenue une cible thérapeutique dans le traitement des cancers. Deux types de médicaments ont été développés : d une part des anticorps se fixant sur le récepteur et empêchant la fixation de l EGF et, d autre part, des inhibiteurs du domaine intracellulaire du récepteur (domaine tyrosine kinase). Dans le cadre des CCR, sont actuellement disponibles des anticorps anti-egfr. 40 % des CCR présentent de façon spontanée une mutation du gène k-ras (mutation de l ADN tumoral). Cette mutation du gène k-ras entraîne une activation constitutive de la protéine RAS : celle-ci active alors de façon continue la voie de transduction correspondante, quel que soit l état du récepteur EGF en amont (donc même lorsque celui-ci n est pas activé par l EGF) Données cliniques : Plusieurs études rétrospectives, dans le cadre du CCR, ont démontré la valeur prédictive de la mutation k-ras des CCR dans la réponse au traitement par anti-egfr : les patients porteurs d une tumeur avec mutation k-ras répondant significativement moins bien aux anticorps anti-egfr que les patients présentant une tumeur sans mutation du gène k-ras.

6 6 Ces données rétrospectives ont été confirmées dans une étude prospective évaluant le PANITUMUMAB (VECTIBIX ). Il s agissait d une étude de phase III chez des patients présentant un CCR métastatique traité en 3 ème et 4 ème ligne évaluant le PANITUMUMAB versus l absence de traitement spécifique chez 463 malades (Van Custem E et al., ASCO 2007). Le statut k-ras était déterminé chez 427 malades (92 % d effectif), le taux de réponse objectif était nul en cas de présence d une mutation k-ras alors qu il était de 17 % en l absence de mutation k-ras et la survie sans progression était à 7,3 semaines en cas de mutation k-ras versus 12,3 semaines. Ces données ont débouché sur une autorisation de mise sur le marché du PANITUMUMAB en monothérapie dans le CCR après échec de la chimiothérapie, limitée aux patients porteurs d une tumeur sans mutation k-ras. L analyse a posteriori d une étude de phase III utilisant l ERBITUX va dans le même sens (Etude CRYSTAL, Van Custem E et al, ASCO 2007). Il s agit d une étude concernant des patients en première ligne de traitement d un CCR métastatique évaluant le FOLFIRI versus FOLFIRI + CETUXIMAB chez 1200 malades. Le statut k-ras a été analysé chez 577 malades : 35 % d entre eux présentaient un CCR avec mutation k-ras. Il existait une différence en terme de réponse objective (43% versus 59 %) entre les 2 bras de traitement dans la population sans mutation k-ras alors qu il n existait aucune différence de réponse objective entre les 2 bras dans la population des patients avec mutation k-ras. Cette étude a de même mené à une restriction de l AMM concernant l ERBITUX pour la sous-population des patients présentant une tumeur sans mutation k-ras. A ce jour, les données cliniques peuvent se résumer ainsi : En cas de CCR avec mutation k-ras : La probabilité de réponse objective (des stades avancés pré-traités par chimio.) aux Ac anti-egf-r en monothérapie est inférieure à 1 % De même l association Ac anti-egf-r + chimiothérapie n augmente pas la probabilité de réponse par rapport à la chimiothérapie seule dès la 1ère ligne de traitement. Bien que 12 à 50 % de stabilisations (réponses tumorales) aient été notées dans les études rétrospectives, les études prospectives ne montrent aucun bénéfice en terme de survie sans progression lors de l adjonction d anti EGF-R (en monothérapie ou combiné à la chimio). En cas de CCR avec k-ras non muté («wild type») : Majoration de l ordre de 10 à 15% brut de taux de réponse objective en première ligne lors de l association des Ac anti EGF-R aux schémas de chimiothérapies à base d irinotecan ou oxaliplatine. Comment et où? K-RAS est une protéine nœud de la signalisation intra-cellulaire. Elle fonctionne comme un interrupteur, alternant un état actif lorsque la protéine est liée au GTP et un état inactif lorsqu elle est liée au GDP. Les mutations k-ras sont observées dans environ 40% des CCR. Il s agit de mutations ponctuelles dont plus de 90 % d entre elles se situent au niveau des codons 12 et 13. Ces mutations sont de type substitution de base et sont hétérozygotes. En fonction de la position de la mutation dans le codon, l acide aminé traduit sera différent : ainsi les mutations du codon 12 et 13 transforment une glycine en un autre acide aminé : acide aspartique (mutation G12D, la plus fréquente), valine (mutation G12V), etc. On dénombre environ une dizaine de mutations transformantes pour les codons 12 et 13 de k-ras. Six d entre elles représentent plus de 99 % de ces mutations et ont été impliquées dans la réponse aux anti- EGFR : ce sont les mutations recherchées dans les laboratoires d analyse en routine.

7 7 L affectation du domaine de liaison GTP par ces mutations explique leur conséquence fonctionnelle en terme d activation constitutive de la protéine KRAS. En effet, les mutations de la glycine sur les codons 12 et 13 altèrent l activité GTPase, empêchant le retour à la forme inactivée de la protéine K-ras (= activation constitutive). La recherche de mutation du k-ras (génotypage k-ras) dans la tumeur se fait en trois étapes : 1) Extraction de l ADN 2) Amplification de l ADN tumoral extrait 3) Détection et identification de la mutation. L extraction de l ADN peut se faire à partir de la tumeur primitive ou de la métastase, sur biopsie ou pièce d exérèse chirurgicale. Elle doit être réalisée sur un bloc riche en cellules tumorales (+ de 70 à 80 % de cellules tumorales). Elle nécessite que la tumeur ait été congelée ou fixée dans des fixateurs compatibles avec des études de biologie moléculaire (privilégier le formol +++ ou des fixateurs adéquats pour la biologie moléculaire). Cette analyse est donc totalement incompatible pour les tumeurs conservées dans du liquide de Bouin. Il existe de multiples méthodes de recherche de la mutation K-ras basées sur des déclinaisons ou des combinaisons de plusieurs techniques. Elles s appliquent toutes sur de l ADN tumoral amplifié par PCR. Une étape importante est le choix de la zone tumorale qui sera amplifiée. En effet, du fait du caractère hétérozygote des mutations de k-ras, il faut pouvoir analyser un tissu tumoral très riche en cellules tumorales en excluant le maximum de cellules normales. C est le rôle du pathologiste de choisir le bloc de tumeur et de sélectionner sous microscope la zone tumorale qui sera extraite («macrodissection»). Parmi les techniques les plus utilisées, on peut citer le séquençage direct, le pyroséquençage, l hybridation spécifique d allèles, la séparation de fragments et l analyse de courbe de fusion à haute résolution (HRM). Il n existe à ce jour pas de recommandation ni de consensus concernant la technique qui doit être utilisée. Chaque technique présente des caractéristiques différentes en terme de sensibilité, spécificité, coût, rapidité et adaptation à l échantillon tumoral fourni. A Toulouse, la recherche est effectuée par deux techniques : détection de la mutation par HRM, puis identification de la mutation par hybridation spécifique d allèle. 3. : Prise en Charge des PRELEVEMENTS TUMORAUX Ces informations sont communes aux 2 types d analyses moléculaires disponibles en pratique clinique pour les CCR (RER et k-ras) Fixation des prélèvements L influence de la fixation sur la qualité des acides nucléiques est bien connue. Les fixateurs avec acide picrique (Bouin, Duboscq Brasil) ne permettent aucune exploitation des acides nucléiques. Il existe à ce jour 3 grandes familles de fixateurs : fixateur formolés, fixateur à base de glyoxal et fixateurs dépourvus d aldhéhydes. Ces deux derniers types de fixateur sont développés en tant que «substitut du formol» afin de répondre aux normes d utilisation du formol dans les laboratoires.

8 8 En terme de biologie moléculaire, la fixation formolée (à condition qu elle soit réalisée dans de bonnes conditions c est-à-dire dans du formol 10 % tamponné, neutre et n excédant pas 48 heures) permet la réalisation de la plupart des analyses moléculaires à visée diagnostique. Les fixateurs sans aldhéhydes à base d éthanol donnent d excellents résultats en terme de biologie moléculaire. Les autres fixateurs aldhéhyques à base de glyoxal sont en cours d évaluation mais donnent à ce jour des résultats très variables. L expérience du laboratoire d Anatomie Pathologique du CHU Purpan (Pr Brousset) en terme d analyse moléculaire des tumeurs colo-rectales fixées en routine dans la région Midi- Pyrénées montre : - Pour l instabilité microsatellitaire : 100 % de tests RER analysables dans les tissus congelés ou fixés formol, environ 50 % dans les tissus fixés en AFA ou d autres fixateurs dont la nature n est pas connue, - Pour les mutations k-ras : 100 % de tests analysables pour les tissus congelés, fixés formol 10 % ou RCL2 (fixateur sans aldhéhyde), 70 % pour les tissus avec un fixateur non précisé, 45 % pour l AFA. Au total, en septembre 2008, un peu plus de 80 % des échantillons adressées à la plateforme ont pu être analysés pour la recherche de mutation KRAS. Depuis, le taux de résultats obtenu a un peu augmenté par l utilisation de techniques plus sensibles telles que l HRM et d hybridation spécifique. Ces résultats soulignent l importance, pour chaque laboratoire d anatomie pathologique de connaître la qualité de l ADN (et d une façon générale des acides nucléiques) obtenue avec son fixateur. Cette exigence, ajoutée aux nouvelles réglementations d utilisation du formol, constitue une véritable difficulté mais également un challenge pour les laboratoires d anatomie pathologique. Tumorothèque régionale La tumorothèque régionale a été mise en place par les tumorothèques du CHU (S. Valmary), de l ICR (JJ. Voigt) et par ONCOMIP (M. Peter), suite à l appel à projet INCa/DHOS de juillet 2005 destiné à financer la mise en place d un réseau régional autour des tumorothèques existantes. La tumorothèque régionale permet ainsi : - La congélation dans les établissements de la région ; - Le transport par un transporteur conventionné avec Oncomip et le CHU ; - Le stockage des échantillons cryopréservés. Cette tumorothèque régionale est destinée aux tumeurs dites «sanitaires» pour lesquelles les examens de biologie moléculaire réalisés préférentiellement sur des tissus congelés sont nécessaires dans le cadre de la prise en charge du patient. Les tumeurs colorectales en font partie. L ensemble des informations liées à la tumorothèque régionale sont disponibles sur le site rubrique espace professionnel / tumorothèque régionale. Nous insistons sur l importance de la fiche de traçabilité du prélèvement à adresser avec le prélèvement et la fiche de prescription médicale demandant la recherche d analyse de phénotype RER ou de recherche de la mutation k-ras. Plateforme hospitalière de génétique moléculaire des cancers de Midi- Pyrénées La présentation orale (E. Delabesse, responsable de la plate-forme) n a pas pu être effectuée lors de la réunion mais un diaporama complet est disponible sur le site rubrique Compte-rendu de Réunions/ «Information sur l'organisation des tests moléculaires indiqués en pratique clinique dans la prise en charge des cancers

9 9 colorectaux». Le but de cette intervention était de rappeler la définition de la plateforme hosipitalière, de préciser son rôle, son fonctionnement et son financement. Le circuit à suivre On distingue schématiquement 3 étapes : 1) Le clinicien fait la prescription de génotypage (RER ou k-ras) à l aide d une fiche de prescription téléchargeable sur le site ONCOMIP 2) Le médecin anatomo-pathologiste détenteur du prélèvement tumoral reçoit la prescription et envoie la tumeur au laboratoire de génotypage accompagnée d une fiche de transfert de matériel téléchargeable sur le site d ONCOMIP 3) Le laboratoire de génotypage reçoit la demande, réalise ce génotypage et renvoie les résultats : d une part au clinicien prescripteur et d autre part à l anatomopathologiste qui lui a adressé le prélèvement Etape 1 : Prescription de génotypage par le clinicien. Il est impératif que cette prescription soit réalisée à l aide d une fiche de prescription téléchargeable sur le site rubrique Biologie moléculaire/procédures Fiche «prescription de génotypage k-ras» Fiche «prescription de test RER» L ensemble des rubriques de ces fiches doit être renseigné. Elles sont simples mais indispensables (identification du malade bien sûr, mais aussi identification du médecin prescripteur et identification de l anatomo-pathologiste référent détenteur du matériel tumoral) Etape 2 : Envoi du matériel tumoral au laboratoire de génotypage. La tumeur doit être envoyée accompagnée de la fiche de prescription remplie par le médecin clinicien prescripteur ainsi que d une fiche de transfert de matériel spécifique téléchargeable sur le site rubrique Biologie moléculaire/procédures : Fiche «transfert de matériel tumoral pour génotypage k-ras» Fiche «transfert de matériel tumoral pour test RER» Délais de réponse : Génotypage k-ras : compter 1 à 2 semaines pour la réalisation du génotypage soit 3 à 4 semaines pour le circuit complet à partir de la prescription. Test RER : environ 2 mois.