Le cycle cellulaire - Checkpoints

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1 Le cycle cellulaire - Checkpoints Evènement 1 Evènement 2 Signal Effecteurs Senseur moléculaire Voie d amplification Régulation: complexes protéiques à activité kinasique Phosphorylation de cibles Activation ou inhibition SU cycline régulatrice + SU catalytique = Cdk (Cycline-Dependent Kinase)

2 Le cycle cellulaire: les 5 phases classiques Mitose GAP 2 G2 M G0 quiescence G0 G1 GAP 1 S: Synthèse d ADN; réplication S G1 + S + G2 : Interphase

3 Le cycle cellulaire: les 5 phases classiques G2 M Sortie du cycle G0 quiescence G0 Différenciation Apoptose G1 Retour dans le cycle S

4 Le cycle cellulaire: Q d ADN et masse cellulaire 2 2 A D Masse cellulaire Q d ADN 1 B A croissance 1 B réplication C C ségrégation D - division G1 S G2 M G1 S Interphase

5 Le cycle cellulaire: échelle de temps 21 M 22 0 Durée moyenne (cellule eucaryote): h G2 (E. Coli: 20 min, levure: 90 à 120 min) G1 Neurones adultes: ne se divisent plus bloqués en G0 17,5 S 10 Fibroblastes: quiescents ou sous multiplication rapide (cicatrisation) Hépatocytes: 1 division/an à 1 division/jour (regénération)

6 Le cycle cellulaire: comment reconnaître les phases classiques Microscopie: chromatine condensée, fuseau de microtubules Protéines phosphorylées: histone H3,MPM-2 Centrosome dupliqué: γ-tubuline 4 centrioles: tubuline glutamylée (GT335) G2 M G0 quiescence G0 G1 Centrosome unique: γ-tubuline 2 centrioles: tubuline glutamylée (GT335) Incorporation d un nucléotide «traceur»: Thymidine ( 3 H); BrdU S Démarrage de la duplication des centrioles

7 Le cycle cellulaire: étude par cytométrie en flux Nombre de cellules analysées G0/G1 S G2/M 2n 4n Intensité de fluorescence Iodure de Propidium

8 Le cycle cellulaire: les points de contrôle chez la levure Transition G2/M (fin de prophase) ADN endommagé Réplication incomplète M Transition M/G1 «spindle checkpoint» (transition métaphase / anaphase) Fuseau incomplet G2 G1 S Transition G1/S (point START) NUTRIMENTS Phéromone a/α ADN endommagé

9 Point START chez la levure - phéromone a/α Etat haploïde S Etat diploïde S n 2n 2n 4n M M n n Cellule haploïde Fusion Conjugaison Sporulation, entrée en méiose (Carence nutritionnelle) 2n Cellule diploïde

10 Point START chez la levure - phéromone a/α START a (n) G1 G1 α (n) START Cellule haploïde Facteur α Fusion + + Facteur a a/α 2n Cellule diploïde Les 2 cellules sont en phase G1 et peuvent fusionner

11 Le cycle cellulaire: les points de contrôle chez les métazoaires Transition G2/M (fin de prophase) ADN endommagé Réplication incomplète G2 M Transition M/G1 «spindle checkpoint» (transition métaphase / anaphase) Fuseau incomplet G0 (quiescence) G1 Facteurs de croissance S Transition G1/S (point de restriction) Facteurs de croissance ADN endommagé

12 La Mitose G2/M M/G1 G2 prophase prométaphase métaphase anaphase télophase G1 condensation alignement décondensation chromosomes assemblage désassemblage fuseau mitotique disparition formation enveloppe nucléaire

13 Le point de contrôle G2/M l entrée en prophase est réversible: décondensation de la chromatine après irradiation (minutes) Rieder et Cole, 1998, J. Cell Biol. 142, 1013

14 Le cycle cellulaire: les points de contrôle permettent de synchroniser les cellules M Transition M/G1 «spindle checkpoint» Fuseau incomplet : nocodazole, Colchicine, taxol G2 G0 (quiescence) G1 Métazoaires: Carence ou déprivation en facteurs de croissance arrêt à confluence S Transition G1/S Métazoaires: Facteurs de croissance antimitogènes (TGFβ) Levure: Carence nutritionnelle; addition des facteurs a/α Inhibition de la réplication (aphidicoline, excès de thymidine)

15 Les levures: Nomenclature Saccaromyces cerevisiae (Sc): gène = 3 lettres capitales italiques Ex: CDC28 wt: CDC28 + Mutant récessif: cdc28 - Mutant dominant: cdc28 D Mutant thermosensible: cdc28 ts Schizosaccharomyces pombe (Sp): gène = minuscules italiques Ex: cdc2 Sc/Sp: protéine = 1ère lettre majuscule; pas en italique Ex: Cdc28 Attention!!!! : les numéros affectés ne correspondent pas chez les deux levures (Sc Cdc28 = Sp Cdc2; Sp Cdc28 )

16 Les levures: mitose fermée Mitose Anaphase Division nucléaire Cytodiérèse

17 Le cycle cellulaire de S. cerevisiae Migration nucléaire Formation du fuseau réplication Ségrégation des chromosomes division nucléaire apparition du bourgeon Duplication du SPB cytodiérèse croissance Lodish, 4 th ed.

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19 Le cycle cellulaire de S. cerevisiae: les mutants CDC

20 Le cycle cellulaire de S. cerevisiae: Caractérisation du gène muté par complémentation fonctionnelle Mutant thermosensible (ts) Culture à 25 C Culture à 35 C croissance x Banque Transfection de plasmides (ADN wt) Culture à 35 C X X X Colonie = le gène muté a été complémenté Par le gène introduit lors de la transfection

21 Le cycle cellulaire de S. cerevisiae: Cdc28 et START: coordination croissance-division START X X X cdc24 ts X cdc28 ts cdc7 ts BOURGEONNEMENT REPLICATION DUPLICATION DU SPB X cdc20 ts cdc31 ts DIVISION NUCLEAIRE X cdc3 ts DIVISION CELLULAIRE Croissance

22 Le cycle cellulaire de S. cerevisiae: Cdc28 et START: coordination croissance-division = Réplication + Duplication du SBP + Bourgeonnement

23 Le cycle cellulaire de la levure fissipare Schizosaccharomyces pombe Duplication du SPB Condensation des chromosomes Formation du fuseau réplication Ségrégation des chromosomes division nucléaire cytodiérèse croissance Lodish, 4 th ed.

24 Caractérisation des mutants conditionnels (ts) de cycle de division cellulaire (cdc) exemple chez Schizosaccharomyces pombe WT (sauvage) G1 S G2/M Mutants cdc à température restrictive Arrêt en: G1 S G2 G1 G1

25 Deux classes de mutations chez S. pombe affectent la taille des cellules (perte ou gain de fonction) Perte de fonction Gain de fonction cdc2 D Alberts, 4ème édition Cdc2: inducteur-clé de la mitose

26 D autres gènes influencent l activité de cdc2 chez S. pombe: Cdc25 et wee Déficit en Cdc25 Cellules allongées arrêtées en G2 Mutagenèse des cellules cdc25 ts Isolement de mutants compensateurs de cdc25 ts (phénotype sauvage) Cdc25+ wee1 cdc2d

27 Caractérisation des mutants de compensation de cdc25 chez S. pombe cdc25+ cdc2 D wee1 wee1, cdc2 D S Catastrophe mitotique!!!

28 Bilan des gènes qui influencent l activité de cdc2 chez S. pombe Déficit en Cdc25 Déficit en Cdc2 Déficit en Cdc13 Excès de Wee1 Cellule allongée (G2 allongée) Excès de Cdc25 Déficit en Wee1 petite cellule (G2 raccourcie) D après Alberts, 4ème édition

29 D autres gènes influencent l activité de cdc2 chez S. pombe: modèle issu de l analyse génétique G2 Protéine kinase M Protéine kinase Protéine phosphatase Alberts, 4ème édition

30 Généralisation des résultats SU catalytique de protéines-kinases = Cdk + SU régulatrice = cycline Cycline Cdk B Cdk1 = MPF G2/M et Mitose A 2 C 3 D 4 E 5

31 Ovogénèse et développement précoce du xénope: Maturation méiotique et fécondation de l ovocyte de Xénope (1) Fécondation Globule polaire 1 er cycle: 75 min Lodish, 4 th ed.

32 Ovogénèse et développement précoce du xénope: Maturation méiotique et fécondation de l ovocyte de Xénope (2) 1 er cycle: 75 min 11 cycles de 30 min Blastula : Qqs milliers de cellules Fécondation «Segmentation»

33 Ovogénèseet développementprécoceduxénope Les cycles de division cellulaire dans l oeuf de Xenope : 1) Cycles simplifiés M S 2) Cellules synchrones

34 Caractérisation du MPF dans l ovocyte de Xénope (Masui et Markert, 1970) Expériences de transfert de cytoplasme: - MPF : maturation promoting factor Ovocyte II Ovocyte I Méiose I Méiose II Lodish, 4 th ed.

35 Caractérisation du MPF dans l oocyte de Xénope Expériences de transfert de cytoplasme: Traitement avant transfert DNAse RNAse dialyse Cytoplasme contenant le MPF Protéase Chaleur Ovocyte immature Ovocyte mature (MII)

36 Caractérisation du MPF dans l ovocyte de Xénope Cytoplasme contenant le MPF 0 cycloheximide cycloheximide progestérone

37 Caractérisation du MPF dans l ovocyte de Xénope progestérone cycloheximide MPF

38 Mise en évidence du MPF Le transfert d une petite quantité de MPF actif a la capacité d agir sur un stock préexistant de pré-mpf, inactif mais activable par des modifications post-traductionnelles (puisque CHX insensibles) Le MPF est capable de s auto-amplifier

39 Oscillations du MPF au cours du cycle cellulaire Activité MPF Maturation méiotique

40 Oscillations du MPF au cours du cycle cellulaire Pic d activité MPF à chaque division mitotique embryonnaire Lodish, 4 th ed.

41 Notions de MPF et de SPF; inhibition de la re-réplication MPF SPF Arrêt en G2 Expériences de fusion cellulaire (fibroblastes de souris): Rao et Johnson, 1970

42 Mise en évidence du MPF (Rao et Johnson, 1970)

43 Mise en évidence du MPF (Rao et Johnson, 1970)

44 Caractérisation des cyclines (Hunt, 1980) Expérience de marquage à la méthionine ( 35 S) chez l embryon de palourde

45 Caractérisation des cyclines: (Hunt, 1980) Expérience de marquage à la méthionine ( 35 S) chez la palourde: Mitose Interphase Mitose Interphase cycline A cycline B ribonucléotide réductase Temps

46 Dosage du MPF et de la cycline dans l ovocyte de xénope

47 Mise en évidence de l activité CSF (Cytostatic Factor)

48 La recette pour fabriquer un extrait d ovocyte de Xénope Ecraser les oeufs et collecter le cytoplasme (en présence d EGTA, un chélateur du Ca 2+ ) Cytoplasme en phase MII: extrait CSF Ajouter du calcium pour induire: dégradation du CSF et de la cycline B disparition du MPF sortie de MII

49 Extrait d oeuf de Xenopus laevis centrifugation Collecte du Cytoplasme = extrait CSF interphase + Ca ++ Assemblage du fuseau in vitro Noyau de spermato de Xénope + Tubuline-rhodamine

50 Expériences in vitro dans un extrait CSF + Ca ++

51 Expériences in vitro dans un extrait CSF + Ca ++ La cycline B est responsable et responsable seule des oscillations du MPF

52 Dégradation des cyclines et sortie de mitose

53 Dégradation des cyclines et sortie de mitose Clone de cycline: non dégradable (délétion de 90 aa N term) Expression dans un extrait cyclant Activation du MPF et entrée en mitose Pas de sortie de mitose Pas de désactivation du MPF La cycline doit être dégradée pour inactiver le MPF et sortir de mitose