Patrick Edder, Didier Ortelli, Claude Corvi
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- Sarah Marier
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1 VALIDATION DE METHODES MULTIRESIDUS Applications aux analyses agro-alimentaires alimentaires Patrick Edder, Didier Ortelli, Claude Corvi Service de protection de la consommation Quai Ernest Ansermet 22, 1211 Genève 4
2 Introduction Lignes directrices concernant la validation de méthode pour l analyse de traces de substances organiques et plus particulièrement les méthodes multi-résidus. Elaboration par des praticiens et des experts de l AOAC, FAO, IAEA et IUPAC lors d un workshop en 1999 à Budapest. Hill A.R.C.; Reynolds S.L.; Analyst 124 (1999) Document SANCO/1085/2000 Rev 5 (Draft) de la commission européenne.. Exemples d application d analyses de résidus de pesticides et de médicaments vétérinaires dans les denrées alimentaires
3 Qu est-ce qu une méthode multi-résidus? Analyse simultanée de multiples analytes aux propriétés physico-chimiques différentes et/ou diverses matrices. Application Pesticides Médicaments vétérinaires Analytes 1000 substances Insecticides Fongicides Herbicides Acaricides etc Antibiotiques Antiparasitaires Hormones Promoteurs de croissance Matrices d intérêt Fruits et légumes frais ou séchés. Jus, vin Céréales Huiles Muscles et abats de ruminants, de porcs, lapins, volailles Poisson, crustacés Oeufs Lait Miel
4 Difficulté des méthodes multi-résidus? De très nombreuses substances à observer Un aspect sélectivité et identification très important. Pour les analyses agro-alimentaires, de nombreuses matrices souvent très complexes (organes, miel, œufs, ). Des valeurs limites ou de tolérance très différentes selon les substances et les matrices.
5 Comment valider? Difficile de valider ces méthodes multi-résidus pour toutes les combinaisons d analytes / matrices. Validation initiale incorporant une sélection d analytes et de matrices 1. Matrices représentatives 2. Analytes représentatifs
6 Matrices représentatives d origine végétale Propriétés communes Famille Espèces représentatives I Forte teneur en eau et en chlorophylle Légumes à feuilles Brassica Epinard, laitue, salade Broccoli, choux Légumineuses Pois II Forte teneur en eau, mais peu ou pas de chlorophylle Fruits à pépins et à noyaux Baies Pomme, poire, cerise, pêche Fraise, raisin Légumes-fruits Tomate, poivron Légumes «racines» Carotte, pomme de terre III Forte acidité Agrumes Citron, oranges IV Forte teneur en sucre Raisin sec, datte, miel V Forte teneur en huile ou en graisse Huiles Huiles, lait, chocolat Fruits oléagineux Arachide, pistache VI Matériaux secs Céréales Blé, riz, maïs Produits céréaliers Farine VII Produits riches en huiles essentielles et/ou substances aromatisantes Herbes aromatiques Epices Ail, oignon, persil, thym Epices
7 Matrices représentatives d origine animale I II III IV V Matrice Muscle Foie Reins Graisse Peau Lait Oeufs Miel Fluides biologiques Espèces représentatives Ruminants (bœuf, veau, mouton) Porc Volaille Lapin Poissons, crustacés Vache, chèvre - - Ruminants De grandes variations de composition pour une même classe de matrices : teneur en graisse des viandes, alimentation des animaux, miels.
8 Choix des analytes représentatifs? Différents critères de sélection : - Substances aux propriétés physico-chimiques représentatives d une famille de composés - Substances les plus couramment observées Le nombre d analytes facteur limitant
9 Lignes directrices pour la validation de méthode multi-résidus Validation interne d une méthode optimisée 1. Fonction de réponse / effets de matrice 2. Domaine analytique, précision, exactitude, limites de détection et de quantification 3. Sélectivité 4. Homogénéité des analytes dans l échantillon 5. Efficacité de l extraction Vérification des performances (contrôle de qualité)
10 1. Fonction de réponse effet de matrice Tester la fonction de réponse avec des standards : Linéaire Non-linéaire ,5 3 2,5 2 1, , Choisir les niveaux de concentration adéquats par rapport aux exigences de l analyse et/ou des MRL. Prendre x MRL, MRL et 2-3 x MRL.
11 1. Fonction de réponse effet de matrice Tester la fonction de réponse dans les extraits. Tester chaque matrice représentative. Comparer les deux fonctions de réponse Dosage des sulfamides dans le miel par LC/MS/MS Aire de pic STZ standard STZ miel 1 STZ miel 2 STZ miel Concentration mg/kg
12 2. Domaine analytique, précision, exactitude, limites de détection et de quantification Analyser pour chaque combinaison (analyte représentatif et matrice représentative) au minimum : 5 x QC inférieur, 5 x QC médian, 5 x QC supérieur Critères de validation Concentration Répétabilité % Reproductibilité % Recouvrement moyen Exactitude % 1 g/kg >1 g/kg 0.01 mg/kg >0.01 mg/kg 0.1 mg/kg > 0.1 mg/kg 1mg/kg >1 mg/kg
13 3. Sélectivité -1 Identification = point prépondérant et critique de l analyse Méthode de détection LC ou GC couplé à la MS LC-DAD LC-fluorescence 2D TLC GC-ECD, NPD, FPD Dérivatisation LC-UV/VIS (1 longueur d onde) Sélectivité suffisante si : Nombre ions fragments suffisant Spectre UV caractéristique Méthode complémentaire Méthode complémentaire Si > 2 modes de séparation Si ce n est pas déjà le cas lors de la première méthode choisie Méthode complémentaire
14 3. Sélectivité - 2 Identification par spectrométrie de masse Exigence selon le document SANCO/1085/2000 Principe des points d identification Technique MS MS basse resolution (LR) MS/MS Ion précurseur LR MS/MS Ion fille LR MS haute résolution (HR) MS/MS Ion précurseur HR MS/MS Ion fille HR Points par ion
15 3. Sélectivité - 3 Identification par spectrométrie de masse Exigence selon le document SANCO/1085/2000 : Substance autorisée : min 3.0 pts Substance interdite : min 4.0 pts Technique(s) GC/MS (EI ou CI) ou LC/MS GC/MS/MS ou LC/MS/MS GC-MS-MS ou LC/MS/MS GC/HRMS ou LC/HRMS GC/HR-MS/MS ou LC/HR-MS/MS Nombre ions 4 1 précurseur + 2 filles 2 précurseur + chacun 1 fille 2 ions 1 précurseur + 1 fille Points
16 3. Sélectivité - 4 Le PABA répond au Charm test, se dérivatise et coélue avec la sulfaméthazine Interférences sur deux méthodes totalement différentes! Exemple : interférence d une substance naturelle, l acide paraamino-benzoïque (PABA) lors de l analyse des sulfamidés. Analyse : - Charm II-Test méthode type RIA - Méthode LC-fluorescence avec prédérivatisation H 2 N SO 2 NH R H 2 N COOH Sulfamides PABA
17 3. Validation de la sélectivité Analyse de blancs de matrice représentative : 5 pour les fruits et légumes 20 pour les matrices d origine animale. Couvrir l intervariabilité des matrices Particulièrement difficile pour les matrices d origine animale! S assurer de l absence d interférants dans la région d intérêt Les limites de détection et/ou de quantification sont souvent limitées par la sélectivité et non par la sensibilité de la méthode
18 4. Homogénéité de l analyte dans l échantillon Contrôle de l échantillonnage Contrôle de l homogénéisation de la denrée alimentaire 1000 Kg 1 Kg 100 µl Analyser 5 portions d une denrée échantillonnée et homogénéisée. Comparer les CV avec ceux obtenus lors de la validation.
19 5. Efficacité de l extraction Echantillon dopé Echantillon contaminé Validation au moyen d échantillons blancs dopés nécessaire de vérifier l efficacité de l extraction avec des échantillons contaminés! Analyser min. 5 x un échantillon naturellement contaminé (matériel de référence, test interlaboratoire)
20 Vérification des performances Les performances de la méthode doivent être régulièrement vérifiées par l ajout dans chaque série : -1 Blanc -1 standard tous les 5-10 échantillons pour vérifier si la fonction de réponse est toujours correcte -1 QC pour vérifier le bon fonctionnement de la méthode (création de carte de contrôle) Concentration [µg/kg] Carte de contrôle Essai n
21 Conclusions Exigences bien particulières pour chaque domaine d activité pour définir les critères de validation. Validation des méthodes multi-résidus = travail considérable Se doit d être bien pensé avant d être entrepris, surtout au niveau du choix des matrices et des analytes représentatifs. Méthodes multi-résidus, multi-matrices sont rarement idéales pour l ensemble des analytes et matrices nécessaire de connaître les performances aide à la décision pour les résultats ayant une implication judiciaire. Contrôle permanent des performances capital, même si dossier de validation «béton».
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