Explorations des réponses Immunitaires. L3 Médecine

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1 2012 Explorations des réponses Immunitaires L3 Médecine

2 Rappel sur les réponses Immunitaires

3 DIFFERENTS TYPES DE REPONSES IMMUNITAIRES Naturelle = innée Adaptative Non spécifique Spécifique Immédiate Barrière cutanéo-muqueuse Substances bactéricides ph Equilibre de la flore Interférons Syst. Complément Phagocytes (PN, mono/mρ) Cellules NK Cellules dendritiques Récepteurs spécifiques (TCR BCR) Qlqs jours Mémoire Immunitaire +efficace lors du 2ème contact base des vaccinations Lymphos T Lymphos B Anticorps

4 Défenses Immunitaires innées et adaptatives dans la défense anti-infectieuse 1) Bactéries à multiplication extracellulaire + certains champignons + certains virus et parasites Système du complément Voie alterne Voie des lectines Voie classique (Ag/Ac) Polynucléaires neutrophiles Anticorps Neutralisation des toxines bactériennes Inhibition de l adhérence des bactéries aux épithéliums Opsonisation 2) Bactéries à x intracellulaire + cellules infectées par Virus + parasite à x intracellulaire Cellules T (CD4-CD8) Macrophages NK Coopération entre ces différents acteurs

5 1) Immunité Innée Agent Pathogène: Inflammation tissulaire Complément Interactions PAMP/PRR (TLR) C3a C5a PN Macrophage Monocyte Cytokines Pro-inflammatoires (TNF, IL1, IL6 ) Organes lymphoïdes Ag IFNγ NK C. Dendritique

6 Exploration du Complément: Mesure fonctionnelle CH50 Mesure des protéines du complément GR de mouton + Ac anti GR de mouton Sérum du sujet contenant le complément C3- C4..:Néphélémétrie Dosage fonctionnelle Voie classique Activation du complexe terminal Voie Alterne Lyse du GR Mesure de l hémoglobine libérée DO 50% GR de lapin Résultats: Augmentation : processus inflammatoire Diminution : consommation, déficit [C]

7 Reconnaissance et destruction de la cible par les phagocytes: Ex: PN C3bi C3b CIBLE IgG 1 et 3 PAMPS et TLR Etude numérique : NFS Etude fonctionnelle : Mesure de l expression des molécules d adhérence Mesure du mouvement (chimiotactisme) Mesure de la production des formes réactives de l O2 Exploration de la voie des Toll Like Récepteurs

8 Cellule NK CMH I CD2 CD16 CD56 CMH II CD25 NK activée Cellule NK < + Récepteurs Inhibiteurs Récepteurs activateurs Cellule modifiée tuée CMH I Cellule Tumorale Ou infectée Exploration numérique (cytométrie en flux à l aide d Ac spécifiques des molécules distribuées sélectivement sur les NK). Exploration fonctionnelle (cytolyse).

9 Cellule Dendritique= lien entre Immunité innée et Immunité adaptative Agents pathogènes = NON SOI ± détruits Gram- Gram+ Fungi Virus Motifs conservés au cours de l évolution qui sont reconnus par les récepteurs des cellules de l I innée C. Dendritique mature: C. Présentatrice de l Ag I. innée cytokines Processus de maturation cytokines Activation des Lymphos T C.dendritique immature: phagocytaire Réponses innées CD8 CD4 Réponses adaptatives Tissus Organes lymphoides périphériques

10 2) Immunité adaptative Polarisation de la réponse T T-bet STAT-4 IFNγ Cellulaire (pathogènes à x Intracellulaire IL12 TH1 IL4 GATA-3 STAT-6 IL4 Humorale (pathogènes à x Extracellulaire TH2 T CD4 Naïf TGFβ1 TGFβ1 IL6 RORgT STAT-3 TH17 FoxP3 IL17 TGFβ1 Neutrophile (pathogènes à x Extracellulaire Régulation Négative Thymocyte Treg

11 2) Immunité adaptative TH1/TH2 CD4: TH1 / TH2 APC CD4 Naive T cell IL-12 IL-2 IFNγ Immunité cellulaire (pathogènes à x Intracellulaire) (virus, bacteria, Leishmania major) Th0 Co-stimuli IL-2 IL-4 Th2 IL-4 IL-5 IL-10 IL-13 Immunité Humorale (pathogènes à x Extracellulaire)

12 2-1 Immunité cellulaire IL-2 NK IFNγ CPA CD80/86 CMH II CD28 TCR CD4 CD4 IL-2 IFN-γ IL-2 IFN-γ IFN-γ Macrophage IL-12 TCD4 reconnait peptide associé aux MHC classe II Pré- CTL CD8 CTL CD8 TCR Fas- L CMH I Fas Perforine Granzymes cible Apoptose Lyse T CD8 reconnaît peptide associé aux MHC classe I

13 2-2 Réponse anticorps: activation des LymphosB 1) Pontage de l IgM mb par l Ag signal 1 expression MHC Classe II B7 (costimulation) 2) LTH2 CD4 reconnaît peptide + MHC II présenté par le LB + signal de costimulation B7/CD28 Activation LTH2 qui exprime CD40L Interaction CD40/CD40L signal 2 dans LB 3) LTH2 produit des cytokines LB exprime récepteurs de cytokines Activation, prolifération et différenciation des LB CD4 2 B mémoires Anticorps Plasmocytes

14 Explorations de l Immunité adaptative In Vitro NFS= Nombre de lymphocytes circulants Cytométrie en Flux: - Phénotypage lymphocytaire T et B - Marqueurs d activation lymphocytaire - Marqueurs cellule naïve/cellule mémoire Tests fonctionnels: - Prolifération - Production de cytokines - production d Acs (B) /Tests de cytotoxicité (T) In Vivo Production d Acs (B) Tests d Hypersensibilité retardé (T)

15 Numération lymphocytaire dans le sang circulant Nombre de lymphocytes total dans le sang circulant chez l adulte : /mm 3 Population CD3+= lymphos T: 50-80% /mm 3 Population CD3+/CD4+: 32-52% /mm 3 Population CD3+/CD8+: 20 40% /mm 3 Rapport CD4/CD8 : 1-3 Population CD19+= lymphos B: 5-20% /mm 3 Résultats à interpréter en fonction de l âge chez l enfant.

16 Exploration des Fonctions lymphocytaires ISOLEMENT DES LYMPHOCYTES -Principe/méthode : - gradient de densité - récupération d un anneau cellulaire contenant lymphocytes et monocytes centrifuger C. Mononucléées polynucléaires GR Centrifugation sur un milieu de séparation de densité d = Ficoll-Hypaque

17 Proliferation lymphocytaire : principe Prolifération = reflet global de la capacité de réponse événement tardif

18 Etude de la prolifération lymphocytaire : ACTIVATEURS NON SPECIFIQUES 1) Lectines d origine végétale : liaison à des sucres spécifiques sur la membrane des cellules T Phytohémagglutinine (PHA) Concanavaline A (Con A) B/T Pokeweed mitogène (PWM) 2) Ac monoclonaux dirigés contre: des récepteurs membranaires : capacité d entraîner l agrégation de récepteurs membranaires doivent être préalablement fixés sur un support pour mimer les contacts intercellulaires T anti TCR B anti IgM

19 Etude de la prolifération lymphocytaire : ACTIVATEURS NON SPECIFIQUES (suite) 3) Activation de voies métaboliques impliquées dans la transmission des signaux intracellulaires court-circuitent les signaux membranaires Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) activateur de PKC ionomycine = ionophore calcique activateur d enzyme Ca2+ dépendante Prolifération polyclonale: capacité générale de réponse selon les voies transductionnelles engagées Diagnostic d un déficit Immunitaire sévère

20 Etude de la prolifération lymphocytaire : ACTIVATEURS SPECIFIQUES 1) Antigènes de rappel : antigènes de vaccination tuberculine anatoxine tétanique antigènes de l environnement candidine streptocoque CMV Mesure la capacité à développer une réponse mémoire spécifique 2) Alloantigènes : d histocompatibilité (MLR)

21 Exploration de l Immunité Humorale In Vitro : Dosage des classes d Igs: IgG, IgA, IgM, IgE, IgD Néphélémétrie ELISA Numération des Lymphos B (cytométrie) CD19- CD20-Ig de Mb Etude de leur Production d Anticorps in vitro Après une activation par un agent stimulant des lymphocytes B :Récolte des cellules après 6 à 7 jours de culture: ELISPOT substrat jaune violet Ac PAL PAL YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y In Vivo : Production d Acs spécifiques en réponse à un rappel d Ag vaccinal. Y Y

22 Marqueurs lymphocytes B Marqueur fidèle (toutes les populations quelque soit leur niveau d activation/differenciation : CD19) Marqueurs de différenciation : CD27-/IgM+/IgD+ naifs CD27+/IgM+/IgD+ mémoire avant commutation CD27+/IgM-/IgD- mémoire après commutation

23 Cytométrie en Flux: Explorations de l Immunité cellulaire In Vitro NFS= Nombre de lymphocytes circulants - Phénotypage lymphocytaire T: CD3+ CD4+/- CD8+/- - Marqueurs d activation lymphocytaire (HLA-DR) - Marqueur cellule naïve/cellule mémoire CD45RA+/CD62L+ CD45RA- ou RO+/CD62L+ central mémoire Tests fonctionnels: - Prolifération - Production de cytokines - Tests de cytotoxicité In Vivo Tests d Hypersensibilité retardé CD45RA- ou RO+/CD62Leffecteur mémoire CD45RA+ ou RO-/CD62Lrevertant

24 In Vitro 2) Mesure de la prolifération lymphocytaire T par 2-1-Incorporation de thymidine tritiée 3 TH Expression en cpm et en index de stimulation (cpm test/cpm control négatif) par rapport à des normes chez des sujets sains

25 In Vitro 3)Mesure de la production de cytokines par les cellules immunitaires Activation des cellules en culture non spécifique / spécifique Récolte du surnageant de culture après 24 à 48 h - Dosage Immunoenzymatique - Dosage Cytométrie en flux Récolte du culot cellulaire après 18 à 24 h Quantification des cellules CD4+/CD8+ productrices - Cytométrie en flux - ELISPOT - Quantification des ARNm

26 In Vitro 3-1- Mesure de la production extracellulaire par technique ELISA Différents types d ELISA

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28 Production de cytokines : Méthodes

29 In Vitro 3-2- Mesure de production intracellulaire : par cytofluorométrie en intracytoplasmique Activation des cellules non spécifique/spécifique Blocage de la sécrétion Marquage de membrane Ag de surface Marquage intracellulaire cytokine Lecture en cytométrie de flux

30 In Vitro 3-2-Quantification des cellules T productrices d IFNγ après stimulation - par des peptides de 9 aa réponse des LT CD8+ spécifiques - par des Ag ou peptides 20 aa réponse des LT CD4+ spécifiques Cellules T activées traitées par un inhibiteur qui bloque le transport des protéines blocage des Cytokines dans le RE Fixation et perméabilisation des cellules Pénétration des Ac anti Cytokine et liaison aux Cytokines intracytoplasmiques d après Immunobiology 5, C. A. Janeway

31 In Vitro 3-3-Numération des cellules secrétrices : par ELISpot (Enzyme Linked Immuno Spot) Quantification des cellules T productrices d IFNγ après stimulation par des peptides de 9 aa réponse des LT CD8+ spécifiques par des Ag ou des peptides de 20 aa réponse des LT CD4+ spécifiques Peptides ou antigène substrat jaune IFNγ violet PAL PAL Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Expression des résultats en nb de spots/106 cellules mononucléées

32 In Vitro 4) Test de cytotoxicité : Mesure de la cytotoxicité par relargage de Cr radioactif 1er temps : développement in vitro des cellules effectrices cytotoxiques coculture - de cellules mononucléées du sang périphérique - avec des cellules dites stimulantes, irradiées qui possèdent les antigènes contre lesquels on veut développer des CTL (infection virus recombinant, chargement peptides, transfection gène) Obtention après 5 jours de cellules cytotoxiques spécifiques de l antigène choisi

33 In Vitro 2ème temps : mesure de la cytotoxicité par relargage du 51 Cr par des lignées cellulaires exprimant les molécules du CMH identiques aux CTL et l antigène étudié Cellules cibles marquées avec du Na 2 51 CrO 4 Addition des cellules T cytotoxiques pendant au moins 4H Cellules cibles tuées larguent Le chrome radioactif Immunobiology 5, C. A. Janeway Radioactivité libérée proportionnelle au nombre de cellules détruites

34 In Vivo Hypersensibilité retardée Après un 1er contact avec l Ag CD4 TH1 mémoires Sensibilisées à l Ag: Ex: tuberculine après Infection tuberculeuse Vaccination BCG Nbs autres cytokines et chimiokines Macrophage CPA CD80/86 CMH II CD28 TCR CD4 IL-2 IFN-γ IL-2 IFN-γ IL-2 IL-12 Retardé: délai nécessaire à la rencontre de l Ag avec T spécifiques,prolifération et migration mono/macrophages

35 In Vivo Hypersensiblité retardée : Etude in vivo Hypersensiblité retardée à la tuberculine Injection intra-dermique de tuberculine Lecture 48 h et 72 h après l injection : induration mesurer le diamètre de l induration < 5mm = Réaction négative: Pas de contact antérieur avec BK ou BCG Déficit de la réponse Immunitaire si contact antérieur > 5mm = Réaction positive: contact antérieure Parfois phlycténulaire ou nécrotique: suspicion d infection Histologie montre la présence de lymphocytes T et de nombreux monocytes/macrophages Hypersensibilité à différents Ags présents dans la nature: Candidine etc