VI - VALIDATION DE LA SPECIFICITE D UNE INTERACTION ENTRE DES RECEPTEURS

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1 Page : 58/ 77 VI - VALIDATION DE LA SPECIFICITE D UNE INTERACTION ENTRE DES RECEPTEURS MEMBRANAIRES Toute la difficulté des expériences de RET effectuées dans le cadre de l analyse de l oligomérisation des récepteurs membranaires, réside dans la capacité de distinguer une forte proximité entre deux protéines d une interaction. En effet, la mesure d un signal de RET n est pas toujours la preuve d une interaction spécifique entre deux protéines. D autre part, l absence de signal de RET ne signifie pas forcément qu il n y a pas d interaction. Ces difficultés sont inhérentes à la méthode ainsi qu aux conditions expérimentales qui sont utilisées. A/ EXPERIENCES DE DILUTION Les expériences dites de dilution sont un moyen de distinguer un RET collisionnel (proximité des fluorophores dont la probabilité de rencontre aléatoire augmente avec leur densité), d un RET spécifique (dimères, oligomères). Pour une interaction spécifique, l efficacité du RET est indépendante de la concentration des fluorophores si le rapport donneur/accepteur est maintenu constant (Figure 43). Il est cependant difficile, voire impossible, d obtenir un signal de RET qui ne provienne que des récepteurs membranaires en interaction et cela pour plusieurs raisons : Tout d abord, tous les récepteurs qui sont marqués avec un donneur ne sont pas nécessairement en interaction avec des récepteurs marqués avec un accepteur. Il peut en effet y avoir différentes populations de «récepteurs fluorescents» à la membrane plasmique 40 (monomères donneur ou accepteur, dimères donneuraccepteur, dimères donneur-donneur, dimères accepteur-accepteur, oligomères, etc.), à l origine d un signal de RET non spécifique (Figure 43-a). 40 Il est important de rappeler ici que les analyses sont réalisées sur des populations de cellules qui sont hétérogènes c est à dire qu elles peuvent exprimer, ou pas, à différents niveaux les protéines d intérêt.

2 Page : 59/ 77 Populations de récepteurs pouvant générer du RET collisionnel pour des densités élevées de récepteurs A A Récepteurs monomériques Récepteurs dimériques Récepteurs oligomériques Figure 43-a. Différentes populations de récepteurs pouvant coexister dans la membrane plasmique. La diffusion des récepteurs dans la membrane plasmique (autours de 0,05 m 2.s -1 pour un RCPG) éloigne et rapproche ces populations de récepteurs en permanence. Ces rencontrent aléatoires sont d autant plus fréquentes que la densité des récepteurs dans la membrane plasmique est élevée 41 (Figure 43-a). Ainsi, en baissant la concentration des récepteurs donneur et accepteur simultanément (dilution), le signal de RET tend vers une valeur de RET 0 qui correspond au signal réel de l oligomère (peu de signal dû au RET collisionnel). C est ce type d essai qui est généralement utilisé pour déterminer le niveau d expression optimal des récepteurs (peu de RET collisionnel) avant de faire les expériences de saturation (voir ci-après). Oligomères + collisions aléatoires Oligomères Collisions aléatoires RET 0 RET Concentration de récepteurs ([A]/[D] constant) Figure 43-b. Expérience de dilution en RET. L axe des ordonnées RET correspond au signal de l accepteur en RET normalisé (divisé) par le signal du donneur. L axe des abscisses correspond au rapport accepteur/donneur qui doit être maintenu constant. 41 La densité dépend du niveau d expression des récepteurs à la membrane mais aussi de leur concentration dans des zones de confinement particulières (microdomaines : radeaux lipidiques, etc.).

3 Page : 60/ 77 Expérimentalement, ce type d analyse est peu utilisé car il est difficile de conserver un rapport donneur/accepteur constant sur une large gamme d expression des récepteurs en BRET par exemple. Ce type d analyse est par contre beaucoup plus facile à mettre en oeuvre pour étudier les homodimères de RCPG avec la technique de SNAP-tag en TR-FRET. En effet, il est plus simple de conserver un rapport donneur/accepteur constant (voir optimisation du marquage équimolaire du SNAPtag dans le Chapitre V) en faisant varier la densité de récepteurs SNAP-tag (variation de la quantité de plasmides transfectés) 42. B/ EXPERIENCES DE SATURATION Les expériences de saturation consistent à co-exprimer une quantité constante d un récepteur-donneur avec une quantité croissante d un récepteur-accepteur. En théorie, le signal de RET doit augmenter avec le nombre d accepteurs jusqu à ce que tous les récepteurs portant le fluorophore donneur interagissent avec ceux portant le fluorophore accepteur. Le niveau de saturation est donc atteint lorsque l augmentation du nombre de récepteurs portant l accepteur ne s accompagne plus d une augmentation du signal de RET. Une courbe de saturation est un bon indicateur d une interaction spécifique entre deux récepteurs si ceux-ci sont exprimées à des niveaux physiologiques. Cependant, si la concentration des récepteurs à la membrane plasmique est très élevée, le RET collisionnel peut générer des courbes de saturation proches de celles obtenues pour des interactions spécifiques de récepteurs. 42 Maurel D et al., Nature Methods 2008

4 Page : 61/ 77 Figure 44. Expérience de saturation en RET. L axe des ordonnées RET correspond au signal de l accepteur en RET normalisé par le signal du donneur. L axe des abscisses correspond au signal de l accepteur [A] normalisé par le signal du donneur [D] après excitation directe par une source lumineuse. Pour éviter de faire une expérience de dilution avant les expériences de saturation, il est possible de réaliser dans une même expérience plusieurs courbes de saturation avec des densités de récepteurs variables. Exemple : - Condition contrôle : 10 ng de plasmide donneur avec 0 ; 1 ; 2 ; 5 ; 10 ; 20 et 40 ng de plasmide accepteur. - En gardant un rapport constant entre les 2 plasmides, on dilue par deux la quantité totale de plasmides : 5 ng de plasmide donneur avec 0 ; 0,5 ; 1 ; 2,5 ; 5 ; 10 et 20 ng de plasmide accepteur. - On dilue encore par deux la quantité totale de plasmides : 2,5 ng de plasmide donneur avec 0 ; 0,25 ; 0,5 ; 1,25; 2,5 ; 5 et 10 ng de plasmide accepteur. - Etc.

5 Page : 62/ 77 Comment analyser les courbes? Deux paramètres peuvent être extrait des courbes de saturation : 1 le RET max : il varie en fonction du nombre de récepteurs en interaction mais aussi de la distance et de l orientation entre les fluorophores portés par les récepteurs. 2 le RET 50 : il représente l affinité relative de deux récepteurs associés. a) Si le RET est spécifique (peu de RET collisionnel), les courbes de saturation obtenues pour les différentes densités de récepteurs sont parfaitement superposables. b) Si le RET est en partie ou complètement collisionnel, les courbes de saturation obtenues pour les différents niveaux d expression des récepteurs ne sont pas superposables : - Dans le cas d un RET partiellement collisionnel (RET oligomères + RET collisionnel), le RET max baisse en fonction de la diminution du nombre de récepteurs jusqu à la vrai valeur de RET max qui correspond au signal de l oligomère essentiellement. - Dans le cas d un RET complètement collissionnel, les courbes passent d une courbe de saturation à une droite. A partir des différentes courbes de saturations, il est possible de représenter les données comme illustré dans l expérience de dilution. C/ EXPERIENCES DE COMPETITION Dans cette expérience, la concentration de récepteurs A, B et C ne portant pas de fluorophore est augmentée progressivement tout en conservant un niveau d expression constant des récepteurs A et B portant respectivement le fluorophore donneur et le fluorophore accepteur d énergie.

6 Page : 63/ 77 Il est attendu que le signal de RET diminue si les récepteurs non marqués entrent en compétition pour les sites d interactions entre le récepteur A et le récepteur B portant les fluorophores (Figure 45). Figure 45. Expériences de compétition. Dans le contrôle seuls les récepteurs A-Donneur et B- accepteur sont exprimés. La difficulté de ces expériences de compétition est de garder les niveaux d expressions du donneur et de l accepteur constant alors que la concentration du compétiteur augmente. Il est important d exprimer faiblement les différents partenaires pour éviter de saturer les voies de synthèse et donc de produire une protéine au détriment des autres.