Expérimentons sur les enzymes

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1 NOTICE Expérimentons sur les enzymes Réf. MT DVD scientifique à usage pédagogique de 15 minutes. Objectifs : Proposer une banque d images présentant des manipulations et des expériences sur les enzymes. Les usages possibles tournent autour de : - une vision des consignes données aux élèves avant de manipuler ; - une observation d une manipulation impossible à réaliser en classe (pour différentes raisons : matériel non disponible, temps disponible réduit, ) ; - la présentation d un autre exemple que celui réalisé par les élèves pour analyse et comparaison ; - l utilisation dans le cadre d une évaluation formative ou sommative. Remarque : Les titres de la plupart des séquences peuvent être considérés comme l hypothèse de l expérience présentée. Partie 1 : Observations CONTENU DU FILM Séquence 1 : action d'une graine en germination sur l'amidon. On verse de l eau iodée sur une gélose contenant de l amidon dans deux boîtes de Pétri. Une coloration bleue apparaît. Dans une des boîtes, on dépose un cotylédon de haricot en germination préalablement coupé en deux. La face fraîche est sur le côté gélose. Deux heures après, on observe la décoloration de la gélose dans la boîte contenant le cotylédon. Il y a donc eu disparition de l amidon par action du cotylédon. On met ainsi en évidence sur l amidon une action liée à la présence d un organisme vivant. Durée : 35 secondes 1

2 Séquence 2 : action du pancréas sur du papier imbibé d huile et de tournesol. On prélève un fragment dans un pancréas frais. Il est déposé dans une des deux boîtes de Pétri contenant une rondelle de papier filtre imbibée de teinture de tournesol (bleu en milieu neutre ou basique) et d'huile d'olive neutralisée. Les deux boîtes sont placées dans une étuve à 37 degrés Celsius pendant quelques heures. On observe le virage de la teinture de tournesol au rouge dans la boîte contenant l extrait de pancréas. La variation de couleur est provoquée par les acides gras provenant de l'hydrolyse des triglycérides sous l'action d'une lipase pancréatique. Durée : 1 minute Partie 2 : Amylase / amidon Séquence 3 : l amylase transforme l amidon en glucose. On verse de l empois d amidon dans deux tubes à essais. On ajoute quelques gouttes d amylase dans un tube et l équivalent en eau distillée dans l autre. Les deux tubes sont placés au bain-marie à 37 degrés Celsius. Le contenu de chaque tube est testé avec de l eau iodée toutes les minutes pour suivre la présence d amidon. On observe aucun changement dans la première minute de la réaction. De la deuxième à la cinquième minute, la coloration varie du bleu au jaune en passant par des rouges plus ou moins foncés. On constate donc une transformation de l amidon en présence d amylase. On peut mesurer la teneur en glucose du tube contenant l amylase. La bandelette indique 0,73 g/l. Celle du tube contenant l eau distillée n en contient pas assez pour être mesurable. Il y a donc eu apparition de glucose. C est l amidon qui a été transformé en glucose sous l action de l amylase. Durée : 2 minutes et 30 secondes Séquence 4 : " l action de l amylase dépend de la température ". On verse de l empois d amidon et quelques gouttes d amylase dans trois tubes à essais. Un tube est placé à 2 degrés Celsius dans de la glace fondante. Un tube est placé à 35 degrés Celsius dans un bain-marie. Le dernier tube est placé à 80 degrés Celsius dans un autre bainmarie. Au bout de 5 minutes, le contenu des tubes est testé à l eau iodée. On constate que le tube à 2 C de bleu devient rouge. Le tube à 35 C de bleu devient jaune. Le tube à 80 C reste bleu. Il y a donc eu transformation de l amidon en glucose de façon importante à 35 C, modérée à 2 C et nulle à 80 C. La température agit donc sur l activité de l enzyme avec un optimum à 35 C. Durée : 1 minute et 30 secondes 2

3 Partie 3 : Pepsine / albumine Séquence 5 : " la pepsine agit sur l albumine ". On verse une solution d albumine dans deux tubes à essais. On ajoute dans un tube quelques gouttes de pepsine et dans l autre l équivalent en eau distillée. Les deux tubes sont placés dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Le trouble observé dans les tubes au départ, provoqué par la présence d albumine, disparaît dans le tube contenant la pepsine. Cet enzyme a donc eu une action aboutissant à la disparition de l albumine. Durée : 1 minute et 30 secondes Séquence 6 : " l action de la pepsine dépend du ph ". Dans trois tubes à essais contenant de l albumine, on ajoute un acide, de l eau distillée ou une base afin d obtenir 3 ph très différents : un acide à 1,63, un neutre à 6,65 et un basique à 9,86. La pepsine est alors ajoutée dans les 3 tubes. Les trois tubes sont placés dans un bainmarie à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. On constate que le trouble lié à la présence d albumine disparaît seulement à ph acide. Le ph a donc une action importante sur l activité de l enzyme. Durée : 1 minute et 40 secondes Partie 4 : Protéase / caséine Séquence 7 : " la caséine est hydrolysée en acides aminées par la protéase ". On réalise une chromatographie avec des solutions d acides aminés, une protéine entière, la caséine, et celle-ci hydrolysée par une protéase. Chaque solution est déposée goutte à goutte sur le support à chromatographie. Un sèche cheveux permet de faciliter l évaporation des solvants. La plaque est placée dans une enceinte contenant le solvant de chromatographie. Ce dernier entraîne les molécules différemment en fonction de leur taille. Une révélation de la plaque avec de la nihydrine permet de visualiser les acides aminés. On constate que la protéine entière n est pas visible. Elle n a que très peu migré. Les 3 acides aminés servent de témoins et permettent d affirmer la présence de leucine et de glycine dans la caséine par comparaison avec les acides aminés ayant migré suite à l hydrolysât de la protéine. Durée : 1 minute et 40 secondes 3

4 Partie 5 : Pancréatine / huile Séquence 8 : " la pancréatine agit sur l huile ". On verse dans deux tubes à essai de l huile d'olive neutralisée avec quelques gouttes d émulsifiant. On ajoute de la teinture de tournesol comme indicateur de ph, puis de la pancréatine dans un tube et de l eau distillée dans l autre. On attend quelques heures dans un bain-marie à 37 C. On constate un changement de couleur de bleu à rouge dans le tube contenant la pancréatine. Il s agit d une acidification du ph résultat de l activité de l enzyme ayant hydrolysée les triglycérides en acide gras et glycérol. Durée : 1 minute et 20 secondes Partie 6 : Synthétase / glucose Séquence 9 : une synthèse enzymatique. On filtre une macération dans de l eau de pomme de terre râpée. On teste le filtrat avec de l eau iodée pour montrer qu il ne contient pas d amidon. On verse dans un tube à essai du filtrat avec du glucose-1-phosphate. Le tube est placé au bain-marie à 37 degrés Celsius. Le contenu du tube est testé avec de l eau iodée au cours du temps. On constate l apparition progressive d une couleur bleu foncé permettant d affirmer que de l amidon est synthétisée. Durée : 1 minute et 40 secondes Partie 7 : Peroxydase / gaïacol Séquence 10 : " une cinétique enzymatique". On verse un substrat, le gaïacol, et de l eau oxygénée dans une cuve colorimétrique. On ajoute la peroxydase qui va oxyder le substrat et provoquer l apparition progressive d une couleur sombre mesurable par le colorimètre. Une chaîne d expérimentation assistée par ordinateur va permettre de suivre l évolution de la réaction en fonction du temps. La courbe obtenue permet d'apprécier la cinétique de la réaction. L'obtention d'un plateau caractérise la transformation totale du substrat par l'enzyme. Durée : 1 minute 4

5 Suggestions de manipulations et activités Pour atteindre des objectifs méthodologiques : - S INFORMER S informer sur des images pour réaliser une expérience S informer sur des images pour observer des résultats - RÉALISER Réaliser une manipulation ou une expérience - COMMUNIQUER Schématiser le protocole d une expérience Construire un tableau de résultats (voir les tableaux dans les séquences 4 et 6) Rédiger un compte rendu d une expérience - RAISONNER Ces deux premières séquences pourraient servir pour introduire un sujet sur l'action enzymatique tant chez les végétaux que chez les animaux. Il s agit de poser le problème scientifique : comment la graine en germination (ou le pancréas) agit sur l amidon (ou l huile)? Les autres exemples peuvent servir à développer la démarche expérimentale. Donnons un exemple à partir de la séquence 3 : Problème scientifique : comment l amidon est transformé en glucose par la salive? Hypothèse : dans la salive, une amylase transforme l amidon en glucose. Protocole : voir la séquence Résultat : voir la séquence Observation complémentaire : voir mesure du glucose Conclusion : hypothèse validée. Pour réaliser les manipulations et les expériences : Séquence 1 : action d'une graine en germination sur l'amidon. Couler dans une boîte de Pétri un mélange de gélose et d'amidon. Laisser refroidir. Séparer les cotylédons d'une graine de haricot mise à germer depuis deux jours. Imprégner la surface de la gélose d'eau iodée (coloration bleue) et déposer le cotylédon, la plantule au contact de la gélose. L'observation peut se faire à température ambiante entre 50 et 90 minutes. 5

6 Séquence 2 : action du pancréas sur du papier imbibé d huile et de tournesol. Humecter une rondelle de papier filtre avec de la teinture de tournesol. Laisser sécher. Le tournesol est bleu en milieu basique ou neutre, rouge en milieu acide. Placer la rondelle dans une boîte de Pétri. Imprégner la rondelle d'huile d'olive neutre (voir séquence 8). Poser au centre un fragment de pancréas frais. Mettre le couvercle et placer dans l'étuve à 37 C pendant quelques heures. Séquence 3 : " l amylase transforme l amidon en glucose ". L'amylase est achetée en pharmacie sous la dénomination de "maxilase". Il suffit de faire dissoudre le comprimé dans de l'eau distillée (attention s il existe un enrobage de sucre). Utiliser de l'empois d'amidon à 10 g/l. Mettre 5 ml d'empois d'amidon dans deux tubes à essais, puis ajouter à l'un 1 ml de solution d'amylase et à l'autre 1mL d'eau distillée. Placer au bain-marie à 37 C et tester toutes les minutes un extrait de chaque tube à l'eau iodée. L'utilisation du glucomètre permet d'évaluer la teneur en glucose entre 0,1 et 6g/L. En dessous de la valeur minimale, l'indication "low" apparaît sur l'écran digital. Séquence 4 : " l action de l amylase dépend de la température ". Préparer 3 bains-marie à trois températures différentes 0 C, 37 C, 80 C. Y placer trois tubes contenant 5 ml d'empois d'amidon. Faire de même avec l'amylase. Effectuer les mélanges lorsque les différents produits sont à température adéquate. Au bout de 5 minutes, faire un prélèvement de chaque tube et le tester sur une plaque à l'eau iodée. Séquence 5 : " la pepsine agit sur l albumine ". Mettre 10mL d' une suspension d'albumine acidifié à l'acide chlorhydrique (ph = 1) dans deux tubes à essais. Ajouter dans l'un 1 ml de pepsine diluée à 5g/L et dans l'autre 1mL d'eau distillée. Placer les tubes au bain-marie à 37 C. Lecture des résultats 40 à 50 minutes plus tard. Séquence 6 : " l action de la pepsine dépend du ph ". Mettre 10 ml d'une suspension d'albumine dans trois tubes à essais. Verser quelques gouttes d'acide chlorhydrique dans le premier (ph = 1), neutraliser le second (ph = 7), ajouter de la soude au troisième (ph = 13). Ajouter 1mL de pepsine diluée à 5g/L dans chacun des tubes. Les placer au bain-marie à 37 C. Lire les résultats entre 40 et 50 minutes. 6

7 Séquence 7 : " la caséine est hydrolysée en acides aminées par la protéase ". On utilise une technique de chromatographie sur couche mince (CCM). On utilise une plaque cellulose sur support polyester (temps d'élution plus courts et tâches plus compactes). On dispose de cinq verres de montre dans lesquels on dépose respectivement 1mL de solution de caséine, 1 ml de solution de leucine, 1 ml de solution de glycine, 1 ml de solution d arginine, 1 ml d une solution de caséine hydrolysée. Prendre une pipette capillaire par verre de montre et déposer, sécher chaque goutte pour faire trois dépôts successifs. Placer la plaque dans la chambre à chromatographie garnie du solvant adéquat. Laisser migrer 60 minutes. Révéler à la nihydrine : attention, opération à faire par un adulte sous la hotte du laboratoire. Séquence 8 : " la pancréatine agit sur l huile ". Chauffer 100 ml d'huile d'olive à 50 C à l'aide d'un agitateur chauffant. Préparer une solution de carbonate disodique : verser, goutte à goutte le carbonate puis laisser refroidir. Après 24h, jeter la phase aqueuse, ajouter de l'eau distillée, mélanger et laisser décanter. Vérifiez le ph et recommencer les opérations jusqu'à obtention d'une huile neutralisée. Filtrer. Verser dans deux tubes à essais 5 ml de cette huile neutre, une goutte de liquide à vaisselle (acquisition d'une émulsion stable), deux à trois gouttes de tournesol (indicateur de ph). Dans l'un ajouter 1 ml de pancréatine, dans l'autre 1 ml d'eau distillée. Placer les tubes au bain-marie à 37 C. Après deux heures, on peut observer le virage du tournesol au rouge sous l'action de l'hydrolyse des triglycérides. Séquence 9 : " une synthèse enzymatique ". Râper une pomme de terre sur un cristallisoir entouré de glaçons, ajouter 50 ml d 'eau distillée froide. Après quelques minutes de macération, filtrer le mélange en veillant à recueillir le filtrat dans un récipient entouré de glaçons. Effectuer un prélèvement et le tester à l'eau iodée pour mettre en évidence l'absence d'amidon. Verser dans un tube à essai 2 ml du substrat et 2 ml d'une solution de glucose - 1 phosphate. Placer le tube au bain-marie à 37 C. Effectuer un prélèvement toutes les deux minutes et le tester à l'eau iodée. Au bout de quelques minutes, la coloration bleue de l'amidon apparaît : il y a eu synthèse à partir du glucose-1-phosphate et d'une enzyme présente dans le filtrat. 7

8 Séquence 10 : " une cinétique enzymatique ". Cette séquence introduit l'utilisation d'une chaîne d Ex.A.O. pour évaluer une cinétique enzymatique : - le capteur est constitué par un colorimètre qui compare en permanence la densité optique dans deux cuves (une contenant de l'eau et l'autre un mélange substrat-enzyme ; - les informations sont transmises à l'interface, traitées par l'unité centrale et affichées sur l'écran. Râper radis ou rave sur un cristallisoir, ajouter 50 ml d'eau distillée. Laisser macérer une dizaine de minutes puis filtrer : la solution obtenue contient une peroxydase. Verser dans un tube à essai 1 ml de gaïacol (substrat), 1 ml d'eau oxygénée diluée au 1/100, 1mL de solution tampon phosphate (ph : 6,2). Ajouter 0,5 ml d'enzyme : en quelques secondes, la solution incolore vire au rouge-brun par oxydation du gaïacol en gaïcoquinone. Récapitulatif des tests Réactions hydrolases synthétase oxydase Substrats Glucides Protides Lipides Glucose-1-P Gaïacol Introduction : mise Graine Pancréas en évidence globale sur amidon sur huile Mise en évidence Pomme Amylase Pepsine Lipase in vitro de terre Action température Amylase Action ph Pepsine ExAO Peroxydase Chromatographie Caséine PIERRON Education: 2, rue Gutenberg - B.P SARREGUEMINES CEDEX Tél. : Fax : France : education-france@pierron.fr - Export : education-export@pierron.com Internet : 8