Le monde des bio-puces

Transcription

1 Le monde des bio-puces D1

2 Le «dogme central» de la biologie moléculaire Transcription Epissage Traduction ADN ARNpm ARNm Protéines Génome Transcriptome Protéome D2 Puces à ADN Techniques de génomique fonctionnelle Analyse du génome. du transcriptome. du protéome Puces à protéines

3 Le principe d hybridation des acides nucléiques Complémentarité des bases AT GC Appariement de séquences complémentaires D3 Hybridation possible de séquences non totalement complémentaires Spécificité = correspondance stricte entre les séquences qui s hybrident Spécificité dépend de la stringence du milieu, de la longueur et de la complémentarité des séquences d ADN Stringence : conditions physico-chimiques (température, concentration saline, ph, agents déstabilisant les liaisons H (Ex:formamide) )

4 Concept des puces à ADN (1/2) 1 Dépôt sondes ADN support solide 2 Préparation cibles ADN échantillons biologiques Test Témoin D4 3 Sondes Hybridation Cibles

5 Concept des puces à ADN (2/2) 4 Acquisition et analyse d images Acquisition des images Segmentation des spots Calcul des ratios de fluorescence 5 Traitement et analyse des données D5

6 Assurance et contrôle qualité des puces à ADN Dépôt sondes ADN 1 support solide Préparation cibles ADN D6 le dépôt? le plan d expérience?.. 3 Hybridation cinétique d hybridation? rinçage 4 Acquisition et analyse d images instrumentation? calibration et réglages? segmentation?.. 2 échantillons biologiques quantité & qualité de l extraction des acides nucléiques? cinétique du marquage (direct/indirect)? amplification? purification? 5 Traitement et analyse Des données normalisation

7 On peut tout faire avec des puces à ADN!!!! a Etude de l expression des gènes : le Transcriptome Test Témoin extraction des ARNs totaux purification des ARNm amplification RT-PCR D7 Cibles

8 On peut tout faire avec des puces à ADN!!!! b Etude d anomalies génomiques : amplification / délétion Test Référence purification de l ADN génomique amplification PCR D8 Cibles

9 On peut tout faire avec des puces à ADN!!!! b Etude d anomalies génomiques : amplification / délétion Méthode CGH Comparative Genomic in situ Hybridization Test Référence 1 normal p amplification délétion q D9 Sondes = ADN métaphasique Hybridation Cibles

10 On peut tout faire avec des puces à ADN!!!! b Etude d anomalies génomiques : amplification / délétion Méthode CGH array Test Référence Profil CGH D10 Sondes = ADN métaphasique Hybridation Cibles

11 On peut tout faire avec des puces à ADN!!!! c Analyse à haute résolution : «Tiling array» Résolution variable : longueur des sondes recouvrement des sondes D11 Transcriptome CGH Cartographie de transcrits Recherche d exons Recherche de facteurs de transcription.

12 On peut tout faire avec des puces à ADN!!!! d Interaction protéines/adn : «ChIP on chip» Chromatin ImmunoPrecipitation on Chip fixation in vivo de protéines à l ADN extraction de l ADN (sonication) découpage de l ADN en courts brins sélection de fragment ADN-protéine grâce à un anticorps spécifique précipitation des complexes ADN-protéine-anticorps séparation du complexe pour ne garder que l ADN amplification, marquage hybridation D12 Recherche de sites de fixation de facteurs de transcription

13 On peut tout faire avec des puces à ADN!!!! e Génotypage - Evolution : «SNP array» SNPs fortement conservés au cours de l évolution SNP = deux allèles avec fréquence > 1% Single Nucleotide Polymorphisme sondes correspondantes sur la «SNP array» quatre sondes 2 sondes PM «Perfect Match» 2 sondes MM «MisMatch» D13

14 Quel type de puce!!!! (1/3) Deux modes de fabrication : Par greffage : Par synthèse in situ : on synthétise les sondes on les fixe à un support solide (verre) Avantages : pas de restriction de longueur procédé flexible Inconvénients : densité «moyenne» pas encore d industrialisation Coût moyen D14 on synthétise directement les sondes sur la surface Avantages : haute densité industrialisable Inconvénients : procédé rigide seulement des oligomères Coût dégressif

15 Quel type de puce!!!! (2/3) Contact : Par greffage : Tension capillaire petites gouttes Géométrie connue Plaquage Pulvérisation Qualité du dépôt variable!!! D15

16 Quel type de puce!!!! (3/3) Par synthèse in situ : Oligonucleotides Genechips (Affymetrix) D16

17 Conception de biopuces et plan d expérience TP4 : lundi 12 février 2013 Sélection de sondes par bio-informatique Bases de données généralistes: nucléotides, génome Plans d expérience D17

18 Imagerie des biopuces TP5 : lundi 18 février 2013 Acquisition des images Détection des spots Extraction de l information de fluorescence Assurance et contrôle qualité Organisation et stockage des données D18

19 Analyse de données des biopuces TP6: lundi 4 mars 2013 Description des données Variabilité expérimentale, normalisation Expressions différentielles, seuil de significativité Prédicteur de réponse clinique Profiles d expressions temporelles Comparer des données de biopuces D19