CGH à partir d ADN génomique AGILENT

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1 Page 1 sur 6 Ce protocole décrit les différentes étapes d une expérience de CGH array à partir d ADN génomique de l étape de digestion à celle de lavage des lames hybridées. REACTIFS ET KITS NECESSAIRES Description Fournisseur Ref catalogue Stockage Genomic DNA Labeling Kit Plus (50) Agilent C Oligo acgh Hybridization Kit (25) Agilent TA OligoCGH Wash Buffer 1, 4L Agilent TA OligoCGH Wash Buffer 2, 4L Agilent TA AluI (10U/ul) (500U) Promega R C RsaI (10U/ul) (1000U) Promega R C Microcon YM Millipore TA Human Cot-1 DNA (500ug ) Invitrogen C 1X TE (100 ml) Promega V6231 TA MATERIEL NECESSAIRE - Tubes à vis stériles et Rnase free. - Bain-marie à 37 C, 60 C, 65 C et thermocycleur à 95 C. PRECAUTIONS - Les enzymes ainsi que les solutions contenant de l ADN génomique ne doivent jamais être vortexées PROTOCOLE 1- Qualité de l ADN génomique Il est recommandé de vérifier la qualité de l ADN sur gel d agarose avant toute expérience de CGH array. Préparation du gel agarose 1%: Dissoudre 0,4g d agarose dans 40ml de TBE (erlenmeyer). Chauffer quelques secondes au micro-onde. Transférer la solution dans un tube falcon de 50ml. Sous hotte, introduire 4µl de Sybr Safe. Couler le gel sans attendre. Dépôt des échantillons : Mélanger dans un épendorf :

2 Page 2 sur 6-2µl de bleu de migration - 2µl d eau - 1µl d échantillon d ADN (à environ 100ng/µl) Déposer 4µl de ce mix sur gel et 2µL de ladder. La migration s effectue à 85-90V pendant 45 min (soit une migration d environ 3cm). 2- Digestion (Chauffer le bain-marie à 37 C) Préparer la dilution d ADN génomique nécessaire selon le format de puce utilisé. Format Quantité d ADNg Eau 1 244K 0,5 à 3µg qsp 20,2µl 2 105K ou 4 44K 0,5 à 1,5µg qsp 20,2µl Préparer le mix AluI / RsaI dans la glace et dans l ordre indiqué. Sortir les enzymes sur glace au dernier moment ; homogénéiser par up and down et pipetter avec un cône neuf. Digestion Master Mix Volumes en µl pour 1 réaction H 2 O nuclease free 2 10X reaction buffer C 2,6 Acetylated BSA (10ug/ul) 0,2 AluI (10U/µl) 0,5 RsaI (10U/µl) 0,5 Volume total 5,8 Ajouter 5,8 µl du Mix de disgestion par tube d ADN génomique. Incuber dans un bain-marie à 37 pendant 2 heures. Chauffer à 65 C pendant 20 min pour inactiver les enzymes. Spiner les tubes puis les mettre dans la glace. 3- Vérification sur gel Suivre la procédure décrite en 1 sur 2µl d échantillon digéré.

3 Page 3 sur 6 4- Marquage (kit BioPrime - Invitrogen) (Chauffer le bain marie à 65 C et le thermocycleur à 95 C). Ajouter 5 µl de 2,5 X Random Primers aux 24 µl de solution d ADN. Incuber dans le thermocycleur à eau à 95 C pendant 3 min, spiner et laisser 5 min dans la glace. Ajouter 3µl de cyanine par tube. Déposer la cyanine d un côté du tube et rincer le cône de l autre. Préparer le Mix de marquage dans la glace et dans l ordre indiqué. Labeling Master Mix Volumes (en µl) pour un marquage Eau Nucléase Free 2 5X buffer 10 10X dntp 5 Exo-Klenow 1 Volume Total 18 Ajouter 18 µl du Labeling Master Mix à chaque tube d (ADNg+Cyanine). Incuber dans un bain-marie à 37 pendant 2 heures dans le noir. Chauffer à 60 C pendant 10 min pour inactiver les enzymes puis spiner et placer dans la glace. (Conservation possible à 20 toute la nuit à l obscurité). 5- Purification (Microcon YM-30 Filters) Pour chaque tube d ADN marqué Cy5 et Cy3 (environ 55 µl) Ajouter 430µl de 1X TE et transférer sur colonne. Centrifuger 10 min à 8000 rpm à RT puis vider le tube collecteur Déposer 480 µl de 1X TE (up and down sans toucher la membrane). Centrifuger 10 min à 8000 rpm à RT puis vider Renverser les colonnes sur un tube 1,5 ml propre (maintenir la colonne droite, emboiter le tube collecteur ouverture vers le bas et renverser le tout). Centrifuger 1 min à 8000 rpm à RT Mesurer le volume de chaque éluat. Si ce volume dépasse le volume indiqué dans le tableau suivant, redéposer l échantillon sur son filtre, centrifuger 1 min à 8000 rpm à RT, renverser la colonne sur un tube 1,5 ml et centrifuger 1 min à 8000 rpm.

4 Page 4 sur 6 Format 1 244K 2 105K 4 44K Volume à atteindre 80,5µl 41µl 21µl Compléter éventuellement aux volumes indiqués avec du TE. Mesurer la concentration et l incorporation au NanoDrop (module «microarray») sur 1,5ul d échantillon. Pooler de façon équimolaire les ADN marqués en Cy3 et Cy5 et compléter avec du TE jusqu à atteindre les volumes indiqués ci-dessous. Format 1 244K 2 105K 4 44K Volume à atteindre 158 µl 79 µl 39 µl (Conservation possible à 20 C) 6- Hybridation Chauffer le bain marie à 37 C et le thermocycleur à 95 C. Mettre le Wash buffer 2 à 37 Éventuellement, reconstituer le 10X blocking Agent avec de l eau et attendre 1h. Conservation à 20 C jusqu à 2 mois. L hybridation se fait à T ambiante. 1. Préparation des cibles Préparer le mix d hybridation comme suit : Format 1 244K 2 105K 4 44K Mix Echantillon Cy3/Cy5 158µl 79µl 39µl Cot-1 DNA 50µl 25µl 5µl 10X Bloking Agent 52µl 26µl 11µl 2X hybridation buffer 260µl 130µl 55µl Total 520µl 260µl 110µl Incuber dans un bain-marie à 95 pendant 3 min. Incuber dans un bain-marie à 37 pendant 30 min. Centrifuger 1 min à rpm.

5 Page 5 sur 6 2. Dépôt sur la lame et montage de la chambre d hybridation Déposer la backing slide sur le support de la chambre d hybridation, joint vers le haut («Agilent» vers soi). Déposer le mix d hybridation sur la backing slide sans la toucher, en faisant une ligne de gouttes. Casser les éventuelles bulles avec une pointe de pipette ou le coin d une lamelle. Déposer la lame Agilent «face Agilent contre Agilent», c est-à-dire face active de la puce vers l intérieur. Fermer la chambre, toujours à plat, visser puis faire 1/4 de tour supplémentaire. Mouiller les joints en tournant très lentement la chambre. S assurer qu il n y a bien qu une seule grosse bulle mobile et aucune bulle non mobile. Vérifier que le volume d hybridation soit suffisant. ACCEPTABLE CORRECT INCORRECT Hybrider à 65 C pendant 40 heures (1 244K et 1 105K) ou pendant 24 heures (4 44K), vitesse de rotation 20 rpm. 7- Lavage Attention : ne pas laver plus de 5 lames par bain. o Démonter la chambre d hybridation à plat. o Désassembler la lame et la backing slide dans le 1 er récipient de Wash buffer 1 et décoller la lame à l aide de la pincette fournie avec les chambres ; laisser la backing side tomber au fond du cristallisoir. o Laisser quelques secondes la lame dans le cristallisoir avant de l immerger dans le 2 ème récipient de Wash buffer 1 sous agitation douce. o Mettre au fur et à mesure toutes les lames dans la même orientation et les laisser 5 min à l abri de la lumière.

6 Page 6 sur 6 o Transférer les lames dans le Wash buffer 2 en vérifiant que la T soit toujours à 37. Les laisser 1min sous agitation à l abri de la lumière. o Retirer très délicatement les lames du wash 2.