Exercices supplémentaires en spectroscopie

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1 Exercices supplémentaires en spectroscopie 1

2 Exercices supplémentaires Question 1 Vous voulez faire une analyse multicomposants des trois produits suivants. 1- Sure le graphique qui suit, tracez de manière qualitative le spectre d un mélange des trois produits 2- Lesquels de ces 3 produits auront la plus grande et la plus petite incertitude lors de la quantification multicomposants et pourquoi? 3- Quel effet a la substitution des hydrogènes par des iodes sur le spectre UV-Vis de cette structure? 4- Déterminez les concentrations utilisées pour effectuer le spectre de chacun des trois produits (l = 9 mm)

3 Exercices supplémentaires Question 2 Voici trois spectres (A, B et C) d absorption UV-Vis de la 1,2,4,5-tétrazine dans trois différents milieu. Identifiez quel spectre est acquis dans quel milieu et expliquez pourquoi. -Dans l eau - Dans l hexane -Àl état vapeur A B C 3

4 Exercices supplémentaires Question 3 1- Pourquoi l analyse de la benzidamine doit-elle s effectuer dans un tampon basique? 2- Quelle est la longueur d onde optimale (λ MAX ) pour une analyse quantitative? 3- Calculez le coefficient d absorptivité molaire de cette drogue à λ MAX. 4- Sachant que l erreur sur la transmittance est minimale entre 20% et 70%, calculez les concentrations limites utiles pour une analyse quantitative à λ MAX. 5- Tracez de manière qualitative sur un même graphique les courbes d étalonnage d une analyse à λ MAX, à λ = 235 nm, à λ= 295 nm, à λ = 275 nm et à λ = 190 nm Structure du médicament anti-inflammatoire benzydamine et spectre UV-Vis dans un tampon phosphate ph = 7,5 ; [Bz] = 1 x 10-4 M ; l = 11 mm 4

5 Exercices supplémentaires Question 4 1- Pourquoi le dicyanoanthracene (DCA) est-il fluorescent? 2- Lorsque le DCA est analysé par fluorescence dans différents solvants ses λ EX et λ ÉM varient. Pour quelles raisons? 3- Expliquez la variation pour les trois premiers solvants dans la liste. 4- L ajout progressif d iodobenzene au DCA donne la réponse décrite dans le graphique ci-dessous. Expliquez cet l effet? 5- Quel type de graphique est représenté ci-desous? DCA I 0 : intensité de la radiation excitatrice I : intensité d émission Constante diélectrique 1-2, ,6 3-4, , , , , , , , , , ,44 5

6 Exercices supplémentaires Question 5 1- Voici le spectre d émission de deux lampes. Identifiez ces lampes. 2- Vrai ou faux. Expliquez. a) Plus l intensité d une lampe est grande, plus l analyse par absorption moléculaire est sensible. b) Moins de 10 % des molécules organiques absorbent à λ < 200 nm. c) La lampe dont le tracé est en bleu est utile dans l IR 3- Quel type de lampe est la plus utilisée en fluorimétrie? 4- Quels types de matériaux sont utilisés dans les lampes en IR? 6

7 Exercices supplémentaires Question 6 1- Parmi les trois premiers produits, lequel (lesquels) peuvent être analysés dans l acétone. 2- Pour quelle raison ce solvant est si limitant. Donnez deux solvant qui ne le serait pas pour effectuer une analyse quantitative. 3- Quelle concentration de chacun de ces produits donnerait une absorbance maximale de 0,5 (assumer l = 1 cm)? 4- Lesquels de ces produits doivent être analysés dans un tampon et pourquoi? 7

8 Exercices supplémentaires Question 7 1- Identifiez le spectre d émission, le spectre d excitation, les axes et leurs unités 2- Déterminez a) la longueur d onde d émission b) la longueur d onde d excitation c) le shift de Stokes 3- Calculez le rendement quantique de fluorescence (Φ) 4- Calculez la transmittance, l absorptivité molaire et dérivez une équation qui les relie 5- Le rendement quantique est 3X plus important dans un solvant polaire aprotique tel le DMSO. Discutez de deux autres manières d augmenter le rendement quantique de fluorescence. Analyse fluorimétrique d un carbostiryl dans l eau: - Concentration = 1X10-6 M - Chemin optique = 10 mm - Intensité de la radiation excitatrice = Absorbance de la solution = 0,15 8

9 Exercices supplémentaires Question L enregistrement de ces spectres s est effectué à 5 nm/s. Quelles seront les effets d une augmentation de la vitesse à 100 nm/s? 2- Quelles seront les effets de l élargissement de la fente à la source? 3- Une analyse multicomposants d un mélange inconnu de ces trois produits donne les absorbances suivantes (l = 1cm): λ 322 ; 0,24 λ 358 ; 0,62 λ 370 ; 0,12 Calculez le nombre de moles présentes dans 250 ml de solution. Produit λ(nm) ε (M -1 cm -1 )

10 Exercices supplémentaires Question 9 1- Voici la partie amide I du spectre infrarouge de la protéine citratsynthase suite à un chauffage de la solution pour 50 minutes. Déterminez la composition structurale? 2- Sachant que la composition structurale déterminée suite à une analyse par rayon X de la protéine est celle donnée dans le tableau suivant ; quelle a été l effet du chauffage? Composition; rayon X α-helix 64 β-sheet 1 β-turn 23 désordonné 1 10

11 Exercices supplémentaires Question 10 Tracez un graphique qualitatif montrant la 2 ème dérivée du spectre d absorption d un mélange de ces trois produits. Identifiez les axes. 11

12 Exercices supplémentaires Question Est-il possible de quantifier ces trois benzofuroquinolines par analyse multicomposants? 2- Quelles longueurs d ondes utiliseriez-vous pour effectuer une analyse multicomposants des produits 1 et 2; 1 et 3; 2 et 3? 3- Quelle méthode permettrait une analyse d un mélange de ces trois produits et sur quelle région du spectre serait-elle la mieux applicable? 3 12

13 Exercices supplémentaires Question 12 Voici le spectre d absorption UV-Vis d un mélange de trois produits et le spectre d une dérivée. ma.u Quelle dérivée a été appliquée pour obtenir le spectre du bas? B 2- Nommez toutes les axes 3- Déterminez le signal maximal de chacun des produits dans le spectre dérivée. 4- L étalonnage externe du produit C par la méthode différentielle donne l équation suivante: y = mx+b ; y= 4000[C en mol/l]-0,003 a) que représentent x, y et m? b) comment sont obtenus x, y et m? c) calculer la concentration du produit C ,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 A C -0,1-0,2-0,3-0,4-0,

14 Exercices supplémentaires Question Dessinez le diagramme d énergie représentant le principe de la spectroscopie d absorption en UV-Vis. Expliquez ce qui est quantifié expérimentalement ; où s effectue la lecture expérimentale sur ce diagramme? 2- Dessinez le diagramme d énergie représentant la fluorescence. Comment s appelle ce diagramme? Où s effectue la lecture expérimentale sur ce diagramme? 3- Dessinez le diagramme d énergie représentant l infrarouge. Quelle types d excitations sont analysées en spectroscopie IR? Question 14 Reliez les éléments apparentés cm cm cm -1 IR moyen IR lointain IR proche Réflexion totale Réflexion totale atténuée Réflexion diffuse Photoacoustique Poudre Complexes inorganiques Films Granuliométrie Analyse quantitative Question 15 Vous cherchez à doser la phenylalaline et la tyrosine dans un échantillon alimentaire par spectroscopie infrarouge. Comment vous sera-t-il possible de distinguer entre les patrons spectroscopique de ces deux acides aminés? Spécifiez deux signaux caractéristiques. Les spectres des deux a.a. sont les suivants. 14

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16 Corrigé des exercices supplémentaires en spectroscopie 16

17 Solution Q Le produit bleu possèdera la plus grande incertitude de quantification puisque les deux autres produits absorbent aussi à son λ MAX. Par contraste, le produit rouge possèdera la plus petite incertitude de quantification puisque aucun des deux autres produits n absorbe à son λ MAX. Effectuer une lecture là où il y a une superposition de signaux implique non seulement l addition de l absorbance, mais aussi l addition des incertitudes sur cette absorbances à cette λ. 4- Il suffit d appliquer la loi de B-L Avec l = 9 mm = 0,9 cm A ( λ ) [ x] = = A εl ε ( λ ) l [] x 3- En substituant les H par des I, les énergies des orbitales du noyau aromatique sont modifiées menant à un shift bathochromique. Ainsi, les énergies sont diminuées A (u.a) 1,025 1,05 1,025 [x] moll -1 3,77x10-5 1,28x10-5 1,42x

18 Solution Q. 2 Voici trois spectres (A, B et C) d absorption UV-Vis de la 1,2,4,5-tétrazine dans trois différents milieu. Identifiez quel spectre est acquis dans quel milieu et expliquez pourquoi. B- Dans l eau L état dans lequel se trouve l analyte lors de C- Dans l hexane l analyse UV-Vis affecte son spectre d absorption. A - À l état vapeur À l état vapeur, les molécules sont très espacées et interagissent peu entre elles et avec le milieu. Elles possèdent un grand nombre de degré de liberté menant à des transitions spécifiques A permettant de reconnaître la structure fine complexe des niveaux associés aux divers états électroniques excités. À l état condensé,la liberté rotationnelle est atténué. De plus,la solvatation et B le type de solvant peut restreindre le nombre de degré de liberté d une molécule et élargies (étendre) les énergies des différents états vibrationnels. Contrairement à l hexane, l eau C participe à des ponts hydrogènes avec la tétrazine ce qui diminue le nombre de degrés de liberté de l analyte; il en résulte un élargissement de la raie d absorption. 18

19 Solution Q Il faut travailler dans un milieu basique pour éviter la protonation de l amine tertiaire. De plus, en tamponnant la solution, on s assure d enregistrer le spectre UV-Vis d une seule forme de la drogue. A = 0,57 λ = 306 nm 2- λ MAX = 306 nm 3- A ( λ ) = ε ( λ ) [] x 0,57 ε = 1,1 cm 1 10 l A ε = l[ x] M = M 1 cm 1 4- A = log(t ) [] x = A lε T = 0,2 A = 0,70 [x] = 1,23x10-4 M T = 0,7 A = 0,15 [x] = 2,63x10-5 M 19

20 Solution Q Il existe plusieurs facteurs pouvant affecter la linéarité de la relation B-L : a) Les déviations dans les coefficients d absorptivité molaire aux hautes concentrations (>0.01M) - en raison des interactions électrostatiques entre les molécules - changement de l indice de réfraction b) Dispersion lumineuse par des particules c) Fluorescence / phosphorescence de l échantillon d) Participation à des équilibres chimiques qui sont fonction de la concentration e) Rayonnement polychromatique; les déviations peuvent être minimisées en utilisant une partie relativement plate de la gamme d'absorption telle que le maximum de la bande d'absorption. Les facteurs qui jouent ici sont (a) et (e). Plus l absorbance est grande, plus la sensibilité de l étalonnage est grande (grande pente). Cependant, si λ n est pas un maximum ou un minimum, la gamme linéaire est réduite dû surtout à (e) et les limitations instrumentales. 20

21 Solution Q La structure aromatique et rigide du DCA promeuvent la fluorescence 2- Les interactions solvant / analyte modulent les énergies des orbitales des analytes ce qui affecte directement leur spectre d absorption et d émission. 3- Il y a une augmentation de la constante diélectrique (2,015 < 3,06 < 4,806) qui mène à un shift bathochromique de λ ÉM et λ EX. Plus la constante diélectrique d un solvant est haute, plus les molécule de ce solvant sont aptes à transporter l énergie de manière efficace. Ceci dit, les molécules nécessitent un rayonnement moins énergétique (λ Ξ ) pour promouvoir leurs électrons aux états excités. Une manière analogue d expliquer l effet de la constante diélectrique et de concevoir que son augmentation diminue la vitesse de propagation du rayonnement dans le milieu menant à une compression de l onde, une augmentation de la fréquence et un diminution de la longueur d'ondes. Le rayonnement perçu par les analytes en solution est donc plus énergétique. 4- L iodobenzene contient un atome halogène (iode) qui est reconnu comme un désactivant actif. L iode est un désactivant par collision très efficace. Plus la concentration en iodobenzene augmente, plus la fréquence des collisions augmentent et plus l intensité de fluorescence diminue (I I 0 /I augmente) 5- Ce graphique est du type Stern-Volmer. 21

22 1- Solution Q. 5 Deutérium D 2 Tungstène 2- a) FAUX. En absorption UV-Vis, la mesure de la transmittance est relative (T = I/I 0 ). Une augmentation de l intensité n offre aucun avantage immédiat puisqu en augmentant I 0, I augmente de manière proportionnelle et T reste inchangé. Cependant, il existe une limite inférieure d intensité à utiliser pour effectuer des analyses sensibles. Il existe aussi une limite supérieure pour ne pas décomposer l échantillon. b) FAUX. La grande majorité des molécules organiques et inorganiques absorbent à λ < 200 nm. Àcesλ, l énergie portée aux électrons dans la molécule est assez grande pour exciter les électrons des liens chimiques les plus simples et les moins photosensibles. c) VRAI. Une lampe au tungstène peut être utilisé en IR si elle est adaptée pour émettre à des longueurs d ondes plus grandes (IR 2500 nm nm). Il suffit de chauffer le filament à de plus hautes température (effet de corps noir) dans un gaz inerte pour qu elle ne s oxyde pas en présence d O Lampe au xénon 4- Céramique de haute pureté ou dopées. 22

23 Solution Q Le seuil de coupure de l acétone est très haut, soit près de 350 nm. Donc, il serait seulement possible d analyser la b-carotène qui possède un lmax vers 450 nm. 2- Les solvants étant des molécules organiques, ils possèdent un spectre d absorption qui leur est propre. Ce spectre peut interférer avec celui de l analyte d intérêt en solution. Il faut choisir le solvant d analyse en conséquence des produits analysés. Le seuil de coupure est une propriétés qui aide à faire ce choix. (T > 90%) Comme les maximums d absorption de l aspirine et de la caféine se situent vers 270 nm, les solvants adéquats pour l analyse seraient : l eau, l acétonitrile, l hexane, le méthanol, l éthanol 3- Assumer l = 1cm Produit: ε (M -1 cm -1 ) [x] (M) A = 0,5 b-carotène ,62x10-6 [] x = A lε caféine ,46x10-4 aspirine 425 1,18x10-3 acétone 12 4,16x Les produits contenant une fonction acide ou basique: caféine et aspirine 23

24 24

25 Intensité de fluorescence (u.a.) 1 et 2-3- Φ Φ F F = = I 0 0 λ EX = 410 nm I F I I I / I F 0 Excitation / I I I0 = 2476 I =? 0 I f / I = 92 0 Solution Q. 7 λ ÉM = 540 nm Shift 130 nm 92 / 2476 = 1 0,71 Émission A = 0,15 Longueur d onde λ (nm) A = log( T ) = log( I T = 10 A = 0,128 = I / I 0 = 0,71 / I 0 ) 4- T = 0,71 (calculé en 3) A = εl [] x 0,15 ε = 6 1cm 1 10 M 1 1 = M cm ε = f ( T ) A = log( T ) log( T ) ε = l[ x] A ε = l[ x] 5- Pour augmenter le rendement quantique de la fluorescence, il suffit de diminuer la fréquence des désactivations non-radiatives. Ceci est possible en minimisant les collisions par un abaissement de la température ou une augmentation de la viscosité du solvant de l analyse. 25

26 Solution Q. 8 1 et 2- Référez-vous à vos notes de cours 3- Le graphique du mélange des trois produits donne les absorbances maximales suivantes: λ 322 ; 0,24 λ 358 ; 0,69 λ 370 ; 0,11 Soit: [produit 1] = x [produit 2] = y [produit 3] = z Nous avons 3 inconnus, il nous faut 3 équations pour résoudre le problème: λ 322 0,24 = 5004x +2961y +9178z λ 358 λ 370 0,62 = x y + 7z 0,12 = 39x y + 0z Solution: x = 3,5x10-5 mol/l 8,8x10-6 mol / 250 ml y = 8,8x10-6 2,2x10-6 z = 4,2x10-6 1,05x

27 Assignations région désordonnée cm -1 feuillet β région désordonnée hélice α tours β feuillet β région désordonnée Solution Q. 9 Pic Aire Structure feuil-β désord helix-α tour-β tour-β désord désord. tot.= Composition; rayon X IR α-helix 64 4 A β-sheet 1 14 β-turn désordonné 1 49 B A 1/2 27

28 Solution Q. 10 Il faut se rappeler que lors d une 2 ème dérivée, le maximum d absorbance est un pic négatif et les points d inflexions de chaque pis d absorption donnent des pics positifs. Absorbance ou absorptivité molaire λ d d 2 A 2 λ ou d d 2 ε 2 λ λ 28

29 Solution Q Il est impossible d analyser ces trois produits en même temps car, leurs spectres d absorptions ne montrent pas trois pics distincts et suffisamment bien séparés. 2- Il faut des λ où la différences d absorption est maximale (plus précisément la différence d absorptivité molaire) et se situer à des maximum d absorption pour tous les analytes. (1 et 2) Encore là, le problème se pose, les spectres sont trop semblables (1 et 3) ou 255 nm ou 380nm optimal pour 255 /380 (2 et 3) ou 260 nm ou 380nm optimal pour 260 / Il serait possible d analyser ces trois produits simultanément par spectroscopie différentielle. La région la plus plausible serait celle entre nm puisque les pics y sont les moins larges. Rappelez-vous qu il y a discrimination des pics larges en spectroscopie différentielle ce qui diminuerait le rapport S/N. 29

30 c) [C]=(y-b)/m=4,8x10-5 M Solution Q Il s agit de la quatrième dérivée puisque les maximums d absorption donnent des pics positifs dans le spectre différentiel. Les λ MAX de A et C ne concordent pas exactement avec les maximum de la 4 ème dérivée; c est un inconvénient de la spectroscopie différentielle. 3- A; 0,24 B; 0,4 C;0,19 4- a) x; la longueur d onde, y; la quatrième dérivées de l absorbance, m; la sensibilité (la pente) de l étalonnage par la méthode différentielle. 4 4 d A d A y = mx + b = m C ] dλ dλ [ ] + b = εl[ C b b) x; ce sont les longueurs d ondes balayées lors de l acquisitions du spectre, y; la valeur de la dérivées telle que calculée par l algorithme Savitsky-Golay, m; obtenue suite à une régression linéaire sur les points d analyses de solution étalons. d ma.u. 4 A 4 dλ ,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0-0,1-0,2-0,3-0,4 A B B A C -0, C λ λ 30

31 Solution Q. 13 hν UV-Vis Fluorescence Infrarouge - UV-Vis et IR. La mesure effectué est celle de la quantité d énergie absorbée par rapport à celle qui a été fournie. - Florescence. La mesure effectué est celle de l intensité de la radiation émise: la quantité d énergie réémise suite à l absorption de la radiation excitatrice. - IR. Majoritairement, c est l excitation vibrationnelle (mais aussi l excitation rotationnelle) des liens chimiques qui est observé en spectroscopie infrarouge. Ces excitations proviennent des électrons de l état fondamental qui se déplacent dans leurs états vibrationnels et rotationnels permis. 31

32 Solution Q cm cm cm -1 IR moyen IR lointain IR proche Réflexion totale Réflexion totale atténuée Réflexion diffuse Photoacoustique Poudre Complexes inorganiques Films Granuliométrie Analyse quantitative 32

33 Solution Q. 15 Vous cherchez à doser la phénylalanine et la tyrosine dans un échantillon alimentaire par spectroscopie infrarouge. Comment vous sera-t-il possible de distinguer entre les patrons spectroscopique de ces deux acides aminés? Spécifiez deux signaux caractéristiques (en bleu). Les spectres des deux a.a. sont les suivants. 33

34 cm -1 O-H stretching acide 1513 cm -1 vibration aromatique ~3400 cm -1 N-H élongation cm cm -1 O-H stretching alcool 1609 cm -1 élongation N-H C-N élongation 803 cm -1 torsion C-H 1591 cm -1 aromatique disubstitué (para) élongation N-H ou CH cm -1 O-H stretching acide 1562 cm -1 élongation N-H ou C-H cm -1 C-N élongation 1495 cm -1 vibration aromatique 746 cm -1 et 699 cm -1 balancement C-H aromatique monosubstitué 34