ELECTROPHORESE : Bases physique & Applications Médicales

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1 ELECTROPHORESE : Bases physique & Applications Médicales Dr K CHATTI, 2010 Population cible Etudiants 1 ère Année Médecine Pré-requis Généralités sur la solution, potentiel chimique, propriétés colligatives des solutions 1

2 INTRODUCTION Le phénomène de déplacement d une macromolécule chargée sous l effet d un champ électrique est appelé ELECTROPHORESE (EP) Des protéines en solution, elles sont chargées, c est une règle, lorsque le ph de la solution est différents de leur phi. Lorsqu elles sont placées dans un champ électrique, elles migrent vers l'électrode de polarité opposée. Ainsi on peut séparer les protéines d une solution colloïdale, comme le sérum humain 2

3 Intérêts Biologiques Relargage : séparer une substance en solution de son solvant en introduisant une substance plus soluble Le sérum humain : albumine et globuline L EP a permis sans risque de dénauration une analyse plus fine. L EP est largement utilisée en biologie. - Identification et fractionnement des protéines sur un critère de charge électrique superficielle qui dépend de leur phi - Récupération des protéines 3

4 Objectifs éducationnels 1- Définir l électrophorèse 2- Expliquer le principe d électrophorèse en phase liquide 3- Expliquer le principe d électrophorèse sur papier 4- expliquer le principe de l'électrophorèse sur gel 5- expliquer le principe de l'immunoélectrophorèse 6- expliquer le principe de l'électrofocalisation 7- exposer quelques applications médicales à ces technique 4

5 Fait expérimental Milieu dispersant Au début Colloïde Chargé + après un certain temps Une proréine de charge ze, placée dans un champ électrique E force F = zee Une force de frottement = fv (f = 6 r) Vitesse stationnaire si F = zee = fv v = zee/f Mobilité électrophorétique : Ue Ue Ue = ze/f = ze/6 r Ue = /6 constante dimélectrique du milieu potentiel électrocinétique de la solution 5

6 DEFINITION - L électrophorèse est une méthode de séparation de particules chargée électriquement par migration différentielle sous l action d un champ électrique. - Les particules d une solution colloïdale sont chargées la charge dépend du ph du milieu et du phi de la protéine. Si ph < phi charge négative Si ph > phi charge positive On soumet une solution colloïdale à un champ électrique (ddp) et on étudie le déplacement des protéines de la solution pour les séparer. 6

7 Electrophorèse en phase liquide C B+C B+C+A A A+B Colloïde A+B+C Appareil de Tiselius - Frontière nette initiale et au cours de la migration: --> Constance de la température, l homogénéité du champ électrique et du ph - L électrophorèse en phase liquide permet la mesure très précise des mobilités électrophorétiques et permet ainsi l analyse quantitative dans la mesure où la mobilité électrophorétique permet d identifier les substances. 7

8 Electrophorèse sur papier Ou acétate de cellulose + - Papier - Méthode simple et peu onéreuse - Aussi bien aux petites molécules comme les acides aminés qu aux protéines Mais : drainage des bandes ce qui peut diminuer la résolution 8

9 Electrophorèse sur gel D amidon ou D agar agar Le gel : matrice de polymère baignant dans une solution Tampon Fente d introduction Gel - + Lame de verre Bande à papier Bacs à électrodes - Ces gels contiennent une haute teneur en eau, l adsorption est très faible et la résolution est bien meilleure - gel d agar agar est négativement chargée, ce qui freine considérablement la migration des protéines qui sont chargée positivement 9

10 Electrophorèse sur gel de polyacrylamide + Compartiment supérieur Tampon Joint en caoutchouc Tampon Compartiment inférieur - *Mobilité électrophorétique + un effet de filtration haute résolution surtout les petites *grosses molec plus rétenues par comparaison à une série étalon masse molaire ou la forme d une protéine inconnue. 10

11 Immunoélectrophorèse Deux temps 1. EP sur gel du sérum sanguin à analyser 2. On dispose dans une gouttière, latéralement à l axe de migration un sérum riche en anticorps anti sérum humain. La rencontre AC protéine se traduit par une réaction de précipitation bien visible sous forme d un arc. Diffusion des AC Rainure(dépôt d Ac) Migration élecrophrétique Cette méthode d analyse est - Spécifique : chaque arc une protéine. - Sensible : quelques µl de sérum. 11

12 Electrofocalisation + - Anode ph faible bandes chemise ph élevé thermostatique cathode Les protéines vont se focaliser à des distances différentes correspondant à leur point isoélectrique. En vidant la colonne par le bas de recueillir les différentes fractions protéiques. Résolution : très haute (précision de 0,05 d unité ph) 12

13 Procédés de révélation - les colorants Bleu de bromophénol pour les protides, noir de soudan pour les lipides, acides périodiques puis réactif de Schiff pour les glucides. On peut ainsi localiser les zones par des taches colorées. D - Les isotopes radioactifs : Comptage ou autoradiographie - La fluorescence des substances éclairées par l UV x 13

14 Electrophorèse sur papier du sérum sanguin A 1. 1 globuline 2. 2 globuline β globuline 4. globuline Protidogramme β 1 Lipidogramme 2 Glucidogramme 14

15 EP sur gel d amidon de sérum humain. 15

16 Résumé Méthode EP en phase liquide EP sur papier Le papier est imbibé de tampon, l évaporation est contrôlée EP sur gel d amidon Ou gel d agar agar Le gel est coulé sur une lame EP sur gel de polyacrymalide Réseau de bis-acrylamide polymérisé dans un tube de Verre Immuno-électrophorèse on révèle par les réactions Ag-Ac Electrofocalisation Migration électrophorétique dans un gradient de ph Avantages et inconvénients Principales applications Délicate Simple et peu coûteuse Applicables aux petites et grandes moléc Technique de routine La migration des grosses molécules est lente bonne résolution ADN ARN Facile, Résolution très élevée enzymes Méthode très spécifique Très sensible Interprétation parfois difficile Haute sensibilité Haute résolution 16