PROJET D'IMAGERIE MULTI(X) PHOTONIQUE ETENDUE LARGE BANDE

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1 PROJET D'IMAGERIE MULTI(X) PHOTONIQUE ETENDUE LARGE BANDE (ACTUALISATION 2005) Reconstruction 3D, par microscopie multiphotonique, d un réseau de neurones sensoriels de moelle épinière d embryon de xénope. Collaboration UMR CNRS 6626 / UMR CNRS 6026 Porteurs du projet PIXEL : Mireille BLANCHARD-DESCE, Denis ROUEDE et François TIAHO Responsable de plate-forme : François TIAHO Université de Rennes 1 UMR CNRS 6026 Bât. 13 Campus de Beaulieu Rennes CEDEX francois.tiaho@univ-rennes1.fr

2 1. PRÉSENTATION SYNTHÉTIQUE DU PROJET CONTEXTES SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE ENJEUX ET OBJECTIFS PROJETS SCIENTIFIQUES PLURIDISCIPLINAIRES Imagerie fonctionnelle in vivo du système nerveux embryonnaire de xénope par microscopie multiphotonique Objectif du projet Problématique biologique et stratégie mise en oeuvre Conclusion Imagerie non invasive de foyers cancéreux hépatiques in vivo par MMP Contrôle de la croissance tumorale in vivo dans le foie Analyse de la croissance tumorale par MMP de cellules marquées MMP sur tissus non marqués Mise en place d un système d évaluation in vivo de la fonction de séquences nucléotidiques non codantes Etude in vivo de l imagerie calcique au cours de la neurogenèse à l aide de xénopes transgéniques Apport de la MMP à l'étude de la physiologie de l adaptation et du stress chez les poissons Etude de la régulation spatiale de l'expression de gènes rapporteurs, marqueurs neuronaux, dans des embryons entiers et vivants de poisson zèbre Trafic protéique entre compartiments cellulaires Régulation spatio-temporelle de la transcription COLLABORATIONS INNOVATION & VALORISATION & FORMATION NOUVELLES COMPETENCES HUMAINES VOLET FINANCIER REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES PUBLICATIONS DES EQUIPES CONCERNEES ( ) UMR CNRS 6026, INSERM U 522 et INRA SCRIBE Equipe Biophysique UMR CNRS Equipe Photonique Moléculaire UMR CNRS

3 1. PRESENTATION SYNTHETIQUE DU PROJET Les techniques d excitation non linéaires constituent un véritable saut technologique en sciences de la vie. Ainsi la technique d imagerie par fluorescence induite par excitation multiphotonique (i.e. par absorption simultanée de 2 photons (TPEF) voire 3 photons), en opérant avec des longueurs d onde plus «douces» (i.e. dans le proche infra rouge (IR)), apporte des solutions à des problèmes non résolus par la microscopie confocale. Ces nouvelles techniques permettent en effet d assurer une meilleure pénétration dans les tissus (imagerie en profondeur), de s affranchir des dommages liés à l irradiation par des rayons UV-visible nocifs et d'obtenir une haute résolution spatiale tridimensionnelle (3D). Ainsi, des coupes optiques d épaisseur micrométrique dans le cerveau de souris (et jusqu à des profondeurs atteignant 1mm soit 10 fois plus qu en microscopie confocale classique) ont pu être récemment obtenues in vivo sans dommage pour les tissus. A la suite d une réflexion menée au cours de l année 2002 entre des physiciens, des chimistes et des biologistes de l université de Rennes 1, il est vite apparu qu une véritable dynamique pluridisciplinaire se dégageait pour mettre en œuvre le projet PIXEL : - Les opticiens de l UMR CNRS 6626, récemment regroupés dans l'équipe de biophysique souhaitaient pouvoir développer un prototype permettant d effectuer des analyses en profondeur dans les tissus biologiques et de réaliser de l imagerie de potentiel par génération de seconde harmonique, en anglais «Second Harmonic Generation» (SHG). Ils ont montré dans les deux années qui ont suivi la faisabilité de ce projet en développant le premier exemplaire de microscope multiphotonique sur Rennes et en formant les biologistes à son utilisation. Il est important de noter qu un montage expérimental existe au sein de l UMR CNRS 6626 qui permettra à PIXEL de bénéficier des progrès effectués par la physique. - Les chimistes de l UMR CNRS 6510 ont apporté une contribution innovante dans le domaine des sondes non linéaires répondant au potentiel d action, comme en témoigne le papier cosigné avec W. Webb, un des initiateurs de la microscopie multiphotonique [1]. Ils souhaitent pouvoir développer sur le site de Rennes de nouvelles molécules [2]. - Les biologistes, dans le cadre de la post génomique, souhaitent de plus en plus pouvoir réaliser des observations in vivo avec des méthodes non invasives. Ces recherches concernent aussi bien les équipes travaillant sur le développement embryonnaire (UMR CNRS 6026) que dans le domaine de la cancérologie (INSERM U 522). La plate-forme 1

4 RIO transgenèse, récemment labellisé par le Ministère, sera un partenaire de la plateforme PIXEL qu elle utilisera pour le suivi spatio-temporel non invasif des embryons transgéniques à destination de différentes équipes françaises. L aspect innovation n est pas absent du projet PIXEL. Le développement instrumental en optique et celui de nouvelles sondes pour l observation du vivant sont des enjeux importants sur le plan économique. Cette plate-forme doit permettre le développement d applications dans le domaine de la vectorisation cellulaire et est indispensable pour réaliser les expérimentations nécessaires à l exploitation de brevet qui intéresse actuellement plusieurs entreprises (exemple : brevet n W déposé par l équipe IPC de l UMR CNRS 6026). La plate-forme PIXEL est portée par un consortium de laboratoires de Rennes en biologie (UMR CNRS 6026, INSERM U 522, INRA SCRIBE) chimie (UMR CNRS 6510) et physique (UMR CNRS 6626). Elle est ouverte à des collaborations à l échelle régionale (INRA, Station Biologique de Roscoff, ENS Cachan Antenne de Bretagne) et est amenée à avoir une dimension nationale et européenne. Les différents acteurs du projet PIXEL sont membres de groupements de recherche à l échelle nationale (GDR 2688 Calcium et régulation des gènes, GDR 2588 Microscopie Fonctionnelle du Vivant). Cette reconnaissance est garante d un bon ancrage de la plateforme à l échelle nationale et européenne. Enfin au sein d Europia la plate-forme PIXEL sera complémentaire de la plate-forme PRISM (Plate-forme Rennaise d Imagerie et Spectroscopie structurale et Métabolique) qui permet de faire de l imagerie tissulaire chez le petit animal. PIXEL bénéficiera aussi de toutes les compétences en traitement de l image développé par la plate-forme TSI (Traitement du Signal et de l Information, informatique). Le but du projet PIXEL est de mettre à la disposition de la communauté scientifique un outil moderne et performant d exploration fonctionnelle et spatio-temporelle en 5D (x, y, z,!, t) du vivant permettant d'étudier l'activité biologique à des profondeurs correspondant aux limites de la microscopie multiphotonique (> 1 mm). Des études dynamiques nécessitant des durées longues d acquisitions pourront être mises en œuvre grâce à l utilisation du 2

5 rayonnement IR, moins nocif pour les cellules vivantes. L implantation d une telle plateforme qui s appuie sur une dynamique pluridisciplinaire et sur des compétences complémentaires en optique, physique, biologie et chimie favorisera des démarches scientifiques innovantes. La plate-forme PIXEL dédiée à l imagerie fonctionnelle du vivant s appuiera sur un service de qualité assuré par du personnel dédié et un environnement biologique performant. 3

6 2. CONTEXTES SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE La microscopie multiphotonique (MMP) a été développée à partir du milieu des années 80 par l équipe de W. Webb [1] et est en plein essor de par le monde. Le principe de cette microscopie repose sur l utilisation et le développement de lasers infrarouges (IR) impulsionnels qui excitent des marqueurs moléculaires spécifiques par des processus non linéaires. Contrairement à la figure 1: principe de la MMP, cuve de microscopie confocale qui utilise des lasers continus, la colorant éclairée par un laser Argon visible MMP est caractérisée par une localisation intrinsèque de (à gauche) et par un laser impulsionnel IR (à l excitation (voir figure 1) et permet l exploration de droite). signaux biologiques en profondeur [3]. La MMP permet d'accéder à des techniques nouvelles d'imagerie comme l imagerie de fluorescence induite par absorption à deux photons, en anglais «two photon excitation Fluorescence» (TPEF) et la technique figure 2 : images TPEF et SHG obtenues d imagerie par génération de seconde harmonique, en simultanément à partir d'une culture de cellules anglais «Second Harmonic Generation» (SHG). A titre neurectodermiques de xénope (collaboration UMR CNRS 6626 / UMR CNRS 6026). d exemple, la figure 2 représente deux images TPEF et SHG de cellules indifférenciées issues de neurectoderme d'embryon de xénope. Comme on peut le voir le signal SHG (contrairement au signal TPEF) est strictement membranaire et est absent dans la zone d'adhérence. La spécificité du signal SHG est unique et permet d'apporter des informations sur l'activité électrique membranaire, sur l organisation des marqueurs et leurs distances à l échelle submicrométrique au-delà même des limites fixées par la diffraction [4]. figure 3 : prototype implanté à l'umr CNRS 6626 permettant la double imagerie TPEF-SHG. Le développement de la MMP à Rennes, à l'interface entre la physique, la chimie et la biologie, s'est traduit par la mise en place d un prototype, il y a deux ans, au sein de l équipe biophysique de l'umr CNRS 6626, dans le cadre d'un programme pluriformation financé par le MENRT, le CNRS, la Région Bretagne et Rennes Métropole ( ). Deux 4

7 améliorations majeures ont été mis en œuvre sur le montage commercial existant (voir figure 3) dans le but d'explorer la MMP jusqu à ses limites. En particulier une voie SHG et une voie externe «non descanned channel» ont été implantées sur le prototype pour permettre 1) d effectuer l imagerie du potentiel 2) d'améliorer la profondeur de pénétration dans les tissus biologiques. Cette nouvelle microscopie optique basée sur des interactions non linéaires a très vite détrônée l imagerie confocale conventionnelle grâce à trois avantages principaux [5]: -meilleure pénétration dans les tissus biologiques, - moindre toxicité et photodégradation, - meilleure résolution 3D. Nous comparons sur la figure 4 les microscopies confocale classique et multiphotonique sur du tissu hépatique de souris. Les images mettent clairement en évidence la supériorité du mode non linéaire en terme de profondeur d imagerie (a : microscopie confocale à! = 488 nm, b : TPEF à! = 1032 nm). figure 4 : reconstructions verticales (0-60!m) à partir de piles d images (1 image / 2!m) d'autofluorescence du tissu hépatique non marqué (collaboration UMR CNRS 6626 / INSERM U 522). Les sondes fluorescentes traditionnellement utilisées en microscopie de fluorescence ont servi aux premières étapes du développement de la MMP. Les premières études par cette technique ont concerné la spatialisation et le rôle du calcium dans la transduction des signaux sensoriels [6] et l organisation dynamique spatio temporelle de la chromatine dans des noyaux de cellules vivantes [7]. A partir de biopsies de peau humaine, les contours cellulaires et nucléaires ont pu être observés en 3D pour la première fois avec une très bonne résolution, à des profondeurs de 150!m grâce à l autofluorescence des pyridines NAD(P)H. L utilisation de lasers impulsionnels combinée à l analyse des durées de vie de fluorescence («Fluorescence Lifetime IMaging», FLIM) a permis de créer de nouveaux contrastes avec des sondes non ratiométriques. Ainsi les concentrations intracellulaires de certains ions ont pu être déterminées dans des cellules vivantes en évitant la photo toxicité liée à l utilisation des sondes ratiométriques traditionnelles [8]. En ce qui concerne l'imagerie du cerveau, il a fallu attendre 1997 pour obtenir les premières images de MMP à haute résolution de la structure et de l activité des neurones en 5

8 profondeur chez le rat [9-12]. Les indicateurs de calcium génétiquement modifiés sont des outils puissants pour mesurer l activité de population de neurones in vivo [13, 14] et ont permis d étudier la plasticité dendritique au cours du développement [15]. En combinant MMP et endoscopie, un nouveau pas concernant la profondeur a été récemment franchi et a permis d'obtenir des images subcellulaires à des profondeurs de plusieurs millimètres dans le cerveau de souris [16]. Les premières études dynamiques du cycle cellulaire in vivo par MMP à des profondeurs au-delà de 100!m et pour des durées d enregistrement de 48h ont pu être réalisées au cours de ces trois dernières années sur du cerveau de mammifère [17]. Le poisson zèbre est un excellent modèle de vertébré pour l imagerie cellulaire compte tenu de la relative transparence de ses tissus et du développement externe des embryons et des larves. Chez cette espèce, des études physiologiques ont pu être réalisées par MMP durant de longues périodes chez l'animal entier. Ces études ont concerné la synaptogenèse entre les cellules de Mauthner du tronc cérébral et les motoneurones de la moelle épinière [18], l angiogenèse dans le cerveau [19], le processus de division cellulaire au cours de la neurogenèse dans la rétine [20], l activité calcique de réseaux neuronaux [21, 22] et la détermination de cartes olfactives dans le cerveau [23]. Dans ces différentes études, la MMP, du fait de la relative faible innocuité du rayonnement IR s est révélée plus adaptée que la microscopie confocale à ce type d imagerie de longue durée. L'adaptation de la MMP à des études fonctionnelles de longues durées a été également confirmée récemment chez la drosophile en permettant d élaborer les cartes olfactives glomérulaires [24]. En outre, la MMP a permis de montrer la dynamique de la chromatine nucléaire pendant l interphase des cellules de la lignée cellulaire CHO sur des temps d observations longs [25]. De nouveaux contrastes ont pu être révélés par MMP à partir de molécules endogènes capables de générer des signaux SHG. Ces signaux permettent une imagerie cellulaire in vivo de qualité comparable à l histologie conventionnelle et permettent aussi une imagerie fonctionnelle du métabolisme cellulaire [26]. L'imagerie SHG qui a émergé ces dernières années permet la visualisation 3D in vivo de complexes macromoléculaires constitués d assemblages de protéines très organisées tels que le collagène, les microtubules et la myosine musculaire. Les signaux SHG de certaines sondes sont sensibles au potentiel de membrane, faisant de cette imagerie un outil d exploration cellulaire et fonctionnelle de l activité électrique de cellules et de réseaux neuronaux in vivo [24, 27, 28]. Des études récentes suggèrent que la MMP est aussi un puissant outil d imagerie médicale et de suivi thérapeutique. En effet des pathologies du système nerveux ont été étudiées, in vivo dans le cerveau de souris modèles de la maladie d Alzheimer, et ex vivo dans 6

9 des tranches de cerveaux humains malades [29-31]. Il se dégage des différentes études menées, que la MMP est un outil performant d exploration cellulaire et fonctionnelle in vivo en recherche fondamentale et que les applications en imagerie médicale sont en plein développement. 7

10 3. ENJEUX ET OBJECTIFS Malgré les progrès importants apportés par la MMP à l imagerie du vivant des efforts restent à faire dans différentes directions : - Instrumentation : pour améliorer la profondeur d imagerie au-delà du millimètre il est nécessaire de décaler au-delà du micron les sources d excitation et d adapter en conséquence la détection par une recherche et développement au niveau de l instrumentation. De nouvelles méthodes endoscopiques associées récemment à la MMP ont permis d améliorer significativement la profondeur d imagerie. Leurs développements pourraient avoir un impact considérable en biologie fondamentale et en imagerie médicale. - Sondes génétiquement modifiées : grâce aux programmes de séquençage de génomes de plusieurs organismes animaux et végétaux de nombreux promoteurs seront de plus en plus disponibles pour l adressage cellules- et tissus-spécifiques des chromophores biologiques génétiquement modifiés et dérivés de la GFP et de la DsRed. - Ingénierie moléculaire : l imagerie de potentiel de membrane réalisée par MMP est un enjeu majeur en neurosciences et nécessite l amélioration de la toxicité et de la sensibilité des sondes actuelles. Contrairement à l imagerie de fluorescence classique due à l absorption d un photon, l imagerie non linéaire résulte de l absorption simultanée de plusieurs photons et nécessite le «design» de nouvelles molécules adaptées à ce type d imagerie. Les objectifs du projet PIXEL sont les suivants : i. Mettre à la disposition de la communauté scientifique un outil moderne, performant d exploration fonctionnelle et spatio-temporelle en 5D (x, y, z,!, t) du vivant. ii. Favoriser le développement de projets de recherche innovants aux interfaces physique-chimie-biologie. iii. Contribuer au développement de projets scientifiques d excellence dans les différentes disciplines. iv. Faciliter l émergence de certains axes de recherches pouvant être valorisés par des brevets. v. Assurer une formation scientifique de qualité à des étudiants, stagiaires, enseignants-chercheurs et chercheurs intéressés par l imagerie non linéaire du vivant. 8

11 4. PROJETS SCIENTIFIQUES PLURIDISCIPLINAIRES 4.1. Imagerie fonctionnelle in vivo du système nerveux embryonnaire de xénope par microscopie multiphotonique. Unités concernées: UMR CNRS 6026 (D. Boujard), UMR CNRS 6626 (A. Renault), UMR CNRS 6510 (M. Vaultier) Participants au projet : P. Benquet, D. Boujard, M. Blanchard-Desce, C. Odin, D. Rouède, F. Tiaho, M. Werts Objectif du projet L objectif majeur de ce projet consiste en une analyse fonctionnelle de réseaux de neurones in vivo au cours du développement du système nerveux d un animal modèle d embryologie expérimentale tel le xénope. La combinaison de méthodologies complémentaires d électrophysiologie, de transgenèse, d imagerie par MMP couplées à de nouvelles sondes potentiométriques optimisées est indispensable à la réalisation de cette problématique. Ce projet qui est situé aux interfaces Biologie-Chimie-Physique permettra : i. de comprendre le rôle du développement de l activité électrique dans la différenciation des neurones in vivo. ii. le développement d une nouvelle génération de sondes chimiques optimisées pour l étude de l activité des neurones en général. iii. la conception de solutions techniques innovantes permettant de repousser les limites actuelles en imagerie du vivant Problématique biologique et stratégie mise en oeuvre Des variations transitoires de calcium intracellulaires, initialement mis en évidence dans des précurseurs neuraux chez le xénope puis chez le rat et la souris, jouent un rôle essentiel et/ou régulateur dans la différenciation et la maturation neuronale [32-36, 37, 38]. La compréhension de la mise en place de cette activité doit nous renseigner sur les mécanismes indispensables à la base de la différenciation neuronale (DN). Le rôle de l activité des canaux calciques au cours de la neurogenèse a été particulièrement étudié chez le xénope ces quinze dernières années. Au cours du développement embryonnaire, des canaux calciques fonctionnels précèdent la différenciation des cellules nerveuses et musculaires [39, 40]. Leur activité est indispensable à l induction neurale [41] et la différenciation de neurones 9

12 GABAergiques [42]. L activité de ces canaux génère des variations transitoires de calcium intracellulaire dont la fréquence code la différenciation neurochimique, la croissance et le guidage axonal [35-37, 43]. La source de calcium dans ces trois fonctions est extracellulaire. L équipe de recherche TDNX de l UMR CNRS 6026, s intéresse au rôle des canaux ioniques dans le développement du système nerveux. Elle a ainsi montré que des canaux calciques voltage-dépendants distincts sont impliqués dans la survie et la pousse neuritique de neurones embryonnaires de ganglions cérébroïdes d insecte Periplaneta americana [44-48]. Cette étude a été poursuivie chez l embryon de xénope qui est un modèle d embryologie expérimentale et qui offre de nombreux outils moléculaires (anticorps, séquençage du génome en cours ) et la possibilité de transgenèse. Le rôle des canaux perméables aux ions calcium sur la DN in vitro chez le xénope suggère que la voie transmembranaire de passage de l ion calcium est un déterminant de la sélectivité fonctionnelle de cet ion en relation avec l activité électrique des précurseurs de neurones [49]. Ces résultats, obtenus sur des cultures in vitro, après dissociation des cellules du neurectoderme ont une portée physiologique limitée du fait qu ils ne prennent pas en compte les interactions directes cellules-cellules et indirectes par l intermédiaire de facteurs paracrines et/ou endocrines et de neurotransmetteurs. Pour comprendre le rôle des canaux in vivo et la dépolarisation membranaire, il apparaît indispensable de travailler sur l animal entier et/ou sur du système nerveux intact. À des stades plus avancés du développement du système nerveux, la différenciation des neurones excitateurs et inhibiteurs dépend de la fréquence d activité de leurs précurseurs [43]. De même la co-activité des précurseurs serait un déterminant de la différenciation synchrone de groupes de neurones [35]. Il est donc indispensable de comprendre les interactions entre le signal calcique intracellulaire et le champ électrique transmembranaire in vivo au cours de la différenciation et de la maturation neuronale. Le couplage des imageries calcique et de potentiel par SHG est un point essentiel qui fait déjà l'objet d'un développement conjoint entre les équipes concernées. 10

13 La double imagerie TPEF-SHG développée sur le prototype de l'équipe biophysique du GMCM en collaboration avec l'équipe TDNX est fonctionnelle (cf. 2: Contextes scientifique et technique) et permet l enregistrement de façon simultanée des signaux optiques sous contrôle électrique par la technique de patch-clamp. À titre d'exemple, les variations de signal de fluorescence (TPEF) associées à des sauts de potentiels imposés sur des cellules COS7 (lignée cellulaire issue de fibroblastes de rein de singe) sont enregistrées simultanément in vitro et représentés figure 5. figure 5 : Variations du signal TPEF d'une cellule COS7 marquée au DI-4-ANEPPS sous contrôle électrique par patch-clamp. (collaboration UMR CNRS 6626 / UMR CNRS 6026). Si ces premiers résultats sont encourageants, le développement de la double imagerie pour la compréhension in vivo du rôle de l'activité électrique dans la DN nécessite des efforts supplémentaires en vue d'améliorer entre autre la sensibilité de la détection et les sondes. Dès le début des années 90, Lewis et coll. ont démontré que l imagerie par SHG pouvait apporter une contribution majeure à l imagerie de potentiel [50]. Cette méthode d imagerie ouvrait de nouvelles voies à une imagerie rapide et sensible du potentiel et appelait le «design» de sondes spécialement adaptées. Le groupe «Photonique Moléculaire» de l UMR CNRS 6510 développe des sondes non linéaires (TPEF, SHG) qui répondent au potentiel électrique et qui permettent une imagerie spatio-temporelle du potentiel transmembranaire [51-53]. Au-delà des résultats obtenus [52] qui montrent que de telles molécules sont particulièrement intéressantes pour l étude du système nerveux, il est essentiel d'améliorer la sensibilité des sondes tout en maintenant leur rapidité. Nous mettrons donc en œuvre une démarche d optimisation moléculaire visant à l élaboration de nouvelles sondes peu toxiques. Cette démarche appelle plusieurs étapes : - L'amélioration de la réponse des sondes en solution passe par une optimisation/exaltation de leurs propriétés non linéaires (section efficace d émission de fluorescence induite par excitation multiphotonique, polarisabilité non linéaire ). Les nouvelles sondes non linéaires seront développées selon une approche intégrant à la fois le design (in silico), la synthèse organique et la «qualification» des réponses non linéaires des sondes préparées, réponses qui conditionnent leur utilisation comme sondes au potentiel. 11

14 Cette étape implique notamment la détermination quantitative des caractéristiques photo physiques (spectre de fluorescence, rendement quantique, anisotropie et durée de vie de fluorescence) et des réponses non linéaires (sections efficaces d'absorption à deux photons et réponses non linéaires moléculaires) des sondes en solution. Notons que l équipe photonique moléculaire possède un équipement complet de spectroscopie d absorption et d émission (spectrofluorimètre) permettant de réaliser la caractérisation complète des signatures photo physiques des sondes. Par ailleurs, l équipe photonique moléculaire a également développé un montage expérimental permettant l évaluation quantitative des réponses non linéaires des sondes en solution. Il s agit là d une étape importante car ces paramètres conditionnent la sensibilité de la réponse des sondes au potentiel. Afin de bénéficier de la totalité de la bande spectrale d'utilisation, le dispositif expérimental existant sera complété pour qualifier les sondes émettant dans le rouge et le proche IR. - L'amélioration de la réponse des sondes se fera sur des systèmes modèles tels que les liposomes pour effectuer une évaluation des propriétés optiques non linéaires en milieu membranaire. Cette phase permettra de qualifier les molécules les plus performantes et de préciser / identifier les paramètres physico-chimiques qui contrôlent ces réponses. - Une évaluation «on line» de la toxicité des sondes devra également être effectuée sur les cellules en culture issues de neurectodermes d embryon de xénope. Il est en effet crucial de prendre en compte en amont cette contrainte, la toxicité des sondes étant variable selon le système biologique alors nous nous emploierons à rechercher les sondes optimisées pour l étude du système nerveux de xénope. - L obtention de sondes réellement performantes passera par l analyse de leur réponse au potentiel sur neurones in vitro en couplant électrophysiologie et imagerie de potentiel par SHG. La photo stabilité des sondes est également un paramètre important. Enfin les sondes performantes les plus stables seront utilisées pour étudier la mise en place et la modulation de l activité électrique des neurones d embryons de xénope pendant leur développement. L ensemble de la démarche mise en place devrait donc déboucher sur des sondes adaptées pour une application majeure en neurosciences. L'équipe Biophysique (UMR CNRS 6626) possède l'expertise nécessaire pour proposer des choix et des solutions techniques innovantes afin de repousser les limites actuelles en imagerie du vivant: en témoigne le prototype développé par les opticiens du groupe qui est implanté dans cet UMR (cf. 2: Contextes scientifique et technique). D'autre part, la corrélation spatio-temporelle des signaux optiques et de l'activité électrique des 12

15 cellules nécessite une compréhension fine des mécanismes biologiques et physico-chimiques impliqués dans la réponse microscopique des sondes. Cette compréhension ne peut se faire que par des études conjointes sur le milieu biologique et sur des modèles simulant le comportement des organismes vivants tout en réduisant leur complexité. L'équipe biophysique élabore et met donc en place des outils de modélisation qui simulent le comportement de la membrane biologique. Cette double approche modélisation - système biologique réel est essentielle et elle apportera des concepts nouveaux utilisables en MMP Conclusion Nous espérons à travers ce projet comprendre le rôle physiologique des canaux ioniques et en général l activité bio-électrique dans la neurogenèse in vivo. Ce projet qui est d un intérêt fondamental en neurobiologie du développement nécessite une démarche expérimentale originale et intégrative située aux interfaces entre la biologie, la chimie et la physique. Ce projet de recherche créera une synergie à l'interface de ces trois disciplines et donnera naissance à une thématique de recherche fédératrice originale et compétitive au plan national et surtout international. L optimisation des sondes chimiques pour l imagerie du potentiel du système nerveux engendrera sans doute le développement d une nouvelle méthodologie d'exploration cellulaire et fonctionnelle du système nerveux qui pourrait être valorisée par des brevets. La compréhension des mécanismes clés de la DN, pourrait, à terme, contribuer à mieux appréhender les difficultés actuelles concernant la thérapie de certaines maladies neurodégénératives et accidents vasculaires cérébraux utilisant les greffes de cellules souches. 13

16 4.2. Imagerie non invasive de foyers cancéreux hépatiques in vivo par MMP Unités concernées: UMR CNRS 6626 (A. Renault), INSERM U 522 (C. Guguen-Guillouzo) Participants au projet : G. Baffet, Y. Le Grand, C. Odin, A. Renault L'équipe biophysique de l'umr CNRS 6626 a entamé il y a environ un an, une collaboration avec l équipe Homéostasie du foie de l' INSERM U 522 portant sur l imagerie des tumeurs du foie murin (souris). L imagerie du foie en profondeur (plusieurs centaines de microns) à l échelle sub-cellulaire est une véritable gageure en raison notamment de la forte diffusion du tissu hépatique dans le domaine optique. figure 6 : foyers cancéreux prolifératifs dans le foie extrait Elle est cependant indispensable à l analyse des marquées au dialkylaminostyryl (DiA). mécanismes régulant les cellules hépatiques transformées dans le but de repérer les anomalies de d une souris 12 jours après injection de cellules tumorales Image (235x235!m) obtenue par TPEF à! = 850nm. (collaboration UMR CNRS 6626 / INSERM U 522) régulation durant la prolifération et la motilité in vitro et in vivo. Le blocage de la prolifération et de la survie des cellules transformées, représente un enjeu majeur dans le développement des traitements anticancéreux. Les premières images d un foyer tumoral réalisées par microscopie multiphotonique (MMP) sur le prototype développé dans l équipe Biophysique de l UMR CNRS 6626 (cf. 2: Contextes scientifique et technique) montrent néanmoins le fort potentiel de cette technique optique pour l imagerie sub-cellulaire du foie entier (voir figure 6). Ici, la fluorescence du marqueur lipophile, le DiA, a été excitée par TPEF à 850nm (laser femtoseconde Titane-Saphir). L autofluorescence du tissu hépatique a aussi été démontrée par MMP (voir figure 7). 14 figure 7: tissu hépatique sain non marqué dans le foie murin entier par excitation biphotonique de l autofluorescence excitée à! = 750 nm - image (235x235!m). (collaboration UMR CNRS 6626 / INSERM U 522)

17 La comparaison entre microscopies confocale et multiphotonique a clairement mis en évidence la supériorité du mode non linéaire en terme de profondeur d imagerie (voir figures 8a et 8b), mais l observation déterminante concerne l augmentation très significative de la profondeur d imagerie dans le tissu hépatique lorsque la longueur d onde d excitation passe de 800 à 1030 nm (voir figures 8b et 8c). La profondeur figure 8 : Reconstructions verticales (0-60!m) à partir de piles d images (1 image / 2!m) de coupes histologiques non marquées (autofluorescence du tissu hépatique) a: microscopie confocale à! = 488 nm, b: microscopie d imagerie de cellules marquées est pour l instant de multiphotonique à! = 800nm, c: microscopie l ordre de 200!m aux longueurs d onde proches de multiphotonique à! = 1032 nm. (collaboration UMR 800 nm. CNRS 6626 / INSERM U 522) La résolution des images atteint la limite théorique de diffraction de 0,5!m en latéral et de 1!m en axial. L acquisition de piles d images 2D (z-stacks) permet d ores et déjà de reconstruire off-line des volumes de foie en 3D dans cette fenêtre de 200!m (voir figure 9). figure 9 : Reconstruction 3D (logiciel Amira) d un nodule cancéreux réalisée à partir d une pile de 50 images espacées de 1µm en profondeur obtenues dans un foie entier de souris, 6 jours après injection dans la rate de cellules cancéreuses marquées au DiL (marqueur lipophile de la famille des dialkylaminostyryls). L excitation en mode biphotonique est faite à 850 nm. (collaboration UMR CNRS 6626 / INSERM U 522) Contrôle de la croissance tumorale in vivo dans le foie Le blocage de la prolifération et de la motilité des cellules transformées, représente un enjeu important dans le développement de traitement anticancéreux. L objectif de ce travail, pleinement intégré dans la continuité des travaux effectués dans l équipe «Homéostasie du foie: voie de signalisations régulations et dérégulation», est d analyser les mécanismes régulant les cellules hépatiques transformées dans le but de repérer les anomalies de régulation durant la prolifération et la motilité. Ce projet nécessite la visualisation et 15

18 quantification, in vivo, par une technique non invasive, de la prolifération et la motilité des cellules hépatiques transformées : des hépatocytes issus d hépatocarcinome et des cellules épithéliales d origine biliaire. L objectif est en particulier de démontrer l incidence de l activation de phosphoprotéines des voies de signalisation, les MAPKs, dans la régulation de la prolifération et dans le but de définir de nouvelles molécules antiprolifératives à potentialités anticancéreuses par une approche ciblée par ARN interférence. Les techniques de pointe développées en MMP permettront de visualiser, in vivo, en non invasif, les tumeurs hépatiques. Ce projet nécessite un équipement de pointe ainsi qu un partenariat actif avec des spécialistes de la MMP Analyse de la croissance tumorale par MMP de cellules marquées Une approche consiste à repérer les foyers prolifératifs in vivo après marquage des cellules par une molécule fluorescente permettant une détection par MMP. Les cellules sont marquées in vitro par une molécule lipophile fluorescente (une dialkylaminostyryl et les composés de la même famille qui possèdent une excellente réponse de fluorescence à une excitation biphotonique) ou transfectées par une GFP dans le but d obtenir une expression et/ou un marquage stable. La prolifération de ces cellules in vivo est ensuite analysée par MMP permettant une acquisition d images en coupes de foie semi-épaisses et reconstruction 3D ainsi que des analyses non invasives sur foie entier. Les cellules transformées murines ou humaines sont injectées en sous cutanée (ectopique) ou directement en intra-spleenique. Les études de la croissance tumorale qui sont menées jusqu ici sur des coupes histologiques par microscopie de fluorescence classique seront donc réalisées de façon non-invasive en MMP. Les analyses seront d abord réalisées sur des coupes fines et semi-épaisses (de 10 à 100 µm) afin d optimiser les paramètres expérimentaux (longueur d onde et puissance laser, types d objectifs, concentration en fluorophores ), avant de passer sur le foie entier, in vitro avec sacrifice de l animal, puis sur des animaux anesthésiés. L objectif, à terme, est de pouvoir suivre en temps réel, sur des durées prolongées, la cinétique de la croissance tumorale in vivo ainsi que la prolifération et la motilité de ces cellules dans l animal, ceci en préservant la viabilité des tissus MMP sur tissus non marqués L excitation multiphotonique de la fluorescence endogène des tissus (intrinsèque) permet également d obtenir des images d une résolution suffisante pour une analyse 16

19 histologique de très haute qualité (voir figure 7). Les indicateurs endogènes tels que le NAD(P)H (nicotinamide adenine dinucléotide), le rétinol, les indole amines et le collagène donnent des indications importantes sur la structure et la physiologie/pathologie de l organe. En outre, le collagène peut être imagé sélectivement par microscopie de seconde harmonique (SHG). La combinaison des contrastes de fluorescence (endogène et exogène) et de SHG pourrait s avérer particulièrement puissante pour suivre les processus de migration tumorale des cellules marquées le long des fibres de collagène. 17

20 4.3. Mise en place d un système d évaluation in vivo de la fonction de séquences nucléotidiques non codantes Unités concernées : plate-forme RIO transgenèse, UMR CNRS 6026 (D. Boujard), UMR CNRS 6626 (A. Renault) Participants au projet : P. Benquet, D. Boujard, B. Guillet, T. Madigou, A. Renault, D. Rouède, F. Tiaho La plate-forme RIO transgenèse de Rennes a pour mission de produire des xénopes transgéniques pour la communauté scientifique nationale et internationale. Grâce à la MMP, il est maintenant possible d'observer la spécificité des promoteurs à l échelle cellulaire et en profondeur de façon non invasive sur l'animal entier. L'objectif de cette collaboration est d'utiliser la MMP pour étudier à l échelle cellulaire et in vivo le rôle régulateur de certains promoteurs dans l expression spatio-temporelle de protéines rapporteuses. Plus précisément, le profil d expression spatio-temporel in vivo de dérivés de la GFP et de la DsRed sous le contrôle de différents promoteurs nous renseignera sur la spécificité cellulaire de ces promoteurs et leur régulation au cours du développement. Cette étude sera réalisée chez Xenopus tropicalis compte tenu de sa petite taille et de sa bonne transparence. Une observation morphologique du système nerveux de têtards transgéniques a déjà été faite in vivo par TPEF (voir figure 10). figure 10 : projection en Z d une image de bulbe olfactif de larve de xénope transgénique exprimant l egfp sous le contrôle du promoteur Neuro -" - tubuline,! = 860 nm. (collaboration plate-forme RIO transgenèse / UMR CNRS 6626). 18