Microscopie à fluorescence. Les microscopes

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1 Microscopie à fluorescence par Monique Vasseur Responsable Plateforme Microscopie et imagerie Département de biochimie, UdeM Les microscopes Microscopes optiques: qui utilisent la lumière pour former une image Microscopes électroniques: Microscopes électroniques: qui utilisent un bombardement d électrons pour former l image 1

2 Les microscopes optiques Droit (classique) monoculaire binoculaire Inversé À fluorescence Confocal Microscope droit monoculaire Microscope de brousse Frottis de selles (clinique médicale) Écologie aquatique 2

3 Microscope droit binoculaire Microbiologie Cytologie Histologie Animale Histologie végétale Les microscopes optiques Droit (classique) monoculaire binoculaire Inversé À fluorescence Confocal 3

4 Microscopes droit et inversé Droit Inversé Microscope inversé Études in vivo Cellules vivantes dans leur milieu de culture liquide 4

5 Les microscopes optiques Droit (classique) monoculaire binoculaire Inversé À fluorescence Confocal Microscope inversé à fluorescence Ordinaire À fluorescence 2 e source lumineuse (à haute intensité) Miroir dichroïque et filtres Obturateur du 2 e faisceau lumineux 5

6 28/05/2010 Microscope droit à fluorescence Ordinaire À fluorescence Nikon E800 Microscope à fluorescence Immuno fluorescence Cellules fixées Panoplie de fluorophores pour marquer les organelles 6

7 Microscope à fluorescence Culture de myoblastes exprimant des fluorophores vitaux GFP et mcherry Contrecoloré au DAPI (non vital) Épifluorescence + DIC 100x Qu est ce qu on peut voir dans un microscope à fluorescence? Fluorescence (excitation ti par un photon) Besoin d une source lumineuse luciférase Luciférase OU Luminescence (réaction chimique) Pas besoin de source lumineuse par Résonance de Fluo- ou Lumin. (transfert d énergie) Besoin d une molécule donneuse d énergie très proche (> 1 nm et <10 nm) Visionnement des interactions moléculaires 7

8 Échelle de résolution du microscope à fluorescence 2 nm: «Résolution technique» obtenue par le FRET/BRET Fluorescence 200 nm: limite de résolution théorique du microscope BRET Luminescence Les microscopes optiques Droit (classique) monoculaire li binoculaire Inversé À fluorescence Droit et inversé Confocal 8

9 Microscope confocal Microscope à fluorescence +3 e source lumineuse (lasers) et tête confocale (pinholes) Caméra remplacée par des tubes photomultiplicateurs (PMT) Du microscope à fluorescence au microscope confocal Hg Laser Burner Scanner Aperture Detector Les plans hors focus sont éliminés de l image Objective Cell (Adapted from H. Kapitza) 9

10 Microscope confocal Image prise avec un Microscope à fluorescence Même image prise avec un Microscope confocal Image courtesy of Janos Demeter and Shelley Sazer; Department of Biochemistry, Baylor College of Medicine, Houston, TX. Microscope confocal Coupes optiques sériées Grain de pollen en coupes optiques 10

11 Évolution des microscopes à fluorescence Microscope à fluorescence Confocal «LPS»(Laser Point Scanner) Confocal «Spinning disk» pour les cellules vivantes SIM (Structured Illumination Microscope) live cell Multiphoton TIRF ( Total Internal Reflection Fluorescence) pour observer les membranes Appareillage accessoire Ordre pour allumer Ordre pour éteindre 11

12 Ordre d allumage de l appareillage 1. Registre d utilisation (nom, date, heure d arrivée) Registre à vérifier et compléter Lampe au Hg voltage à 2000 V 3. Lampe au Hg allumage 4. Caméra 5. Obturateur pour le faisceau fluorescent 6. Moteur Z 7. Lampe halogène 8. Ordinateur 9. Écrans Ordre pour éteindre l appareillage Règles pour la lampe au Hg Min. 1h allumée avant d éteindre Min. 1h éteinte avant de rallumer La laisser allumée s il y a un autre utilisateur dans la journée Registre à remplir Ordinateur 2. Écrans 3. Lampe halogène 4. Moteur Z 5. Obturateur pour le faisceau fluorescent 6. Caméra 7. Registre d utilisation du microscope (heure de départ) 8. Lampe au Hg OFF si 12

13 Le microscope droit à la loupe! Ses composantes Et à quoi servent-elles? Le microscope droit à fluorescence en mode lumière transmise «trans illumination» Boîte de contrôle du moteur Z Lampe halogène MoteurZ Voltage de la lampe halogène (min. 6V) Boîte de contrôle de la lampe halogène Interrupteur de la lampe halogène OFF / Dia / Epi 13

14 Trans illumination Contrôle de l intensité lumineuse GIF ND2 ND16 ND32 ND4 D Filtre vert pour améliorer le contraste: «GIF» Filtres de densité neutre: «ND» Filtre diffuseur «D» Microscope droit à fluorescence en mode lumière transmise «trans illumination» Caméra Déviateur Oculaires/Caméra Enfoncé: 100% oculaires Retiré vers extérieur: 100% caméra Analyseur IN OUT Sélecteur de cube de filtres à mettre dans position vide Module du condensateur Filtre polariseur 14

15 Le module du condensateur Platine Tourelle du condensateur Molette pour le réglage de la hauteur du condensateur Diaphragme d ouverture Lentille du condensateur Vis de centrage Mouvements xy Interrupteur lampe halogène OFF / ON / OFF Méthode de contraste: Fond clair Fond clair: «A» Tourelle du condensateur A: Fond clair DF: Fond noir DIC M: 20x 40x DIC H: 60x 100x A Idéal pour les spécimens colorés 15

16 Méthode de contraste: Fond noir Fond noir: «DF» Comparé au Fond clair Tourelle du condensateur A: Fond clair DF: Fond noir DIC M: 20x 40x DIC H: 60x 100x DF Idéal pour les spécimens biréfringents (qui dévient la lumière) Méthode de contraste: DIC Nomarski: «DIC» (DIC = Contraste Interférentiel Différentiel) Comparé au Contraste de phase Tourelle du condensateur A: Fond clair DF: Fond noir DIC M: 20x 40x DIC H: 60x 100x DIC Filtre analyseur IN 2 prismes Filtre polariseur 16

17 Le microscope droit à fluorescence en mode fluorescence Cubes de filtres pour fluorescence Diaphragme de champ Obturateur manuel Obturateur motorisé Lampe au Hg Filtre ND Observation en mode fluorescence Retirer l analyseur 2. Engager le cube de filtre nécessaire 3. Éteindre la lampe halogène 4. Ouvrir l obturateur manuel (enfoncé) 5. Obturateur motorisé Uniblitz: Remote et N.O. 6. Observer aux oculaires et ajuster le diaphragme de champs (pour la fluo) au champs visuel (le champs visuel du 100x est plus petit que celui du 10x) 17

18 Après observation en fluorescence 1 Pour préserver les filtres: 1. Enlever le cube de filtre du trajet lumineux (mettre en position vide) 2 2. Fermer l obturateur manuel (retiré) La lumière intense détériore les filtres avec le temps Le microscope inversé à la loupe! Ses composantes Et à quoi servent-elles? 18

19 Le microscope inversé à fluorescence Éléments reliés à la lumière transmise 1. Source lumineuse au tungstene 2. Filtres IR: anti infrarouge NCB: pour corriger les blancs ND16: densité neutre 1/16 D: diffuseur 3. Diaphragme de champ 4. Module du condensateur 5. Lentille grossissante1,5x 6. Sélecteur de sortie % aux oculaires % vers la caméra 6 37 Le microscope inversé à fluorescence Éléments reliés à la lumière transmise Analyseur 19. Contrôleur du voltage de l ampoule au tungstène 20. Interrupteur ON/OFF pour l ampoule poueau tungstène

20 Trajets lumineux Trans illumination Épi illumination Trans et Épi illuminations Échantillon éclairé par l objectif Importance de ON objectif (NA) pour concentrer les rayons Échantillon éclairé par le condensateur Importance du Köhler pour concentrer lumière 20

21 Illumination en Köhler À faire en lumière transmise (trans illumination) avant chaque séance de microscopie i Fournit un éclairage uniforme du champs visuel Optimise la qualité de l image en résolution et en contraste (netteté) Microscope droit Nikon Eclipse E800 Microscope inversé Nikon TE2000U Illumination en Köhler 1. Se mettre en fond clair «A» avec le 10x ou 20x 2. Enlever l analyseur et le déviateur pour la caméra 3. Ouvrir les diaphragmes de champ et d ouverture 4. Faire la mise au point sur le spécimen 5. Ajuster les oculaires à votre vue 6. Fermer le diaphragme de champ 7. Ajuster la hauteur du condensateur pour visualiser l image du diaphragme de champ dans le même plan focal que le spécimen. 8. Centrer le diaphragme de champ puis l ouvrir jusqu à couvrir le champ visuel (mais pas plus) 21

22 Illumination en Köhler sur le Nikon E Mise au point sur le spécimen en fond clair «A» 2. Fermer le diaphragme de champ 3. Ajuster la hauteur du condensateur pour 4. Centrer le diaphragme de champ 5. Puis l ouvrir pour couvrir le champ visuel 6. Ouvrir le diaph. d ouverture Illumination en Köhler sur le Nikon TE2000U 1. Mise au point sur le spécimen en fond clair «A» 2. Fermer le diaphragme de champ (vers le bas) 3. Ajuster la hauteur du condensateur pour 4. Centrer le diaphragme de champ 5. Puis l ouvrir pour couvrir le champ visuel 6. Ouvrir le diaph. d ouverture 22

23 Alignement de la lampe au mercure Porter des lunettes anti UV Couper l intensité de la lumière avec un filtre de densité neutre Fermer le diaphragme d ouverture (s il y en a) Ouvrir le diaphragme de champ (celui pour l épifluorescence) Enlever un objectif Mettre une feuille de papier blanc sur la platine Aligner l image de la lampe avec la 2e produite par le miroir Les objectifs Description des inscriptions Caractéristiques optiques 23

24 Description d un objectif Corrections optiques Aberrations sphériques Aberrations chromatiques Grandissement Ouverture numérique À sec ou à immersion Méthode de contraste Épaisseur du couvre objet Distance de travail Description d un objectif Corrections optiques Aberrations sphériques (Planéarité) Aberrations chromatiques Grandissement Ouverture numérique À sec ou à immersion Méthode de contraste Longueur du tube optique Épaisseur du couvre objet Distance de travail Objectif non corrigé 24

25 Description d un objectif Corrections optiques Aberrations sphériques (Planéarité) Aberrations chromatiques Grandissement Ouverture numérique À sec ou à immersion Méthode éh de contraste Longueur du tube optique Épaisseur du couvre objet Distance de travail Objectif corrigé pour les aberrations sphériques Description d un objectif Corrections optiques Aberrations sphériques Aberrations chromatiques Grandissement Ouverture numérique À sec ou à immersion Méthode de contraste Longueur du tube optique Épaisseur du couvre objet Distance de travail Différentes longueurs d onde = Plusieurs plans focaux 25

26 Correction des aberrations chromatiques Objectif Standard Objectif Achromate Objectif Apochromate Source: Description d un objectif Corrections optiques Aberrations sphériques Aberrations chromatiques Grandissement Ouverture numérique À sec ou à immersion Méthode de contraste Longueur du tube optique Épaisseur du couvre objet Distance de travail Objectif corrigé pour les aberrations chromatiques 26

27 Description d un objectif Corrections optiques Aberrations sphériques Aberrations chromatiques Grandissement Ouverture numérique À sec ou à immersion Méthode de contraste Longueur du tube optique Épaisseur du couvre objet Distance de travail Objectif grossissant 10x Grandissement (x fois) Grandissement de 2,5x à 100x Avec les oculaires (10x), le grossissement final sera de 25x à 1000x (aux oculaires) Plus le grandissement est grand, moins la lumière passe Plus on grossit, plus l intensité du signal sera diminuée QE = NA 2 /Mag 2 27

28 Description d un objectif Corrections optiques Aberrations sphériques Aberrations chromatiques Grandissement Ouverture numérique À sec ou à immersion Méthode de contraste Longueur du tube optique Épaisseur du couvre objet Distance de travail Ouverture numérique ON ou NA = 0.45 Ouverture numérique: ON ou NA Détermine la résolution de l objectif Influence l intensité du signal en fluorescence Valeur de 0,10 à 1,40 (1,49 à 165TIRF) 1,65 10x objectifs 100x Plus l ouverture est grande, meilleures sont la résolution et l intensité du signal» NA 0.30 NA

29 Résolution en xy En trans illumination d = 1.22 lambda/(naobj + NAcond) En Épi illumination, l objectif sert aussi de condensateur: d = 1.22 lambda/2naobjectif/ Ouverture numérique et Résolution en xy 29

30 Résolution en z (axiale, 3D) Varie selon les indices de réfraction En milieu aqueux: 3 à 4 fois moins bonne qu en xy Sirésolution de 200 µm enxy, sera de ~ 700 nm en z Même bille vue en z Z Résolution en z (axiale, en profondeur) Influence de l indice de réfraction du milieu sur la taille axiale (z) d un dun objet < 10 µm Vue xz d une bille de latex de 6 µm montée dans des milieux ayant des indices de réfraction différents. Air : 1,0 Eau : 1,33 Glycérol : 1,47 Verre : 1,5 Huile à immersion:

31 Description d un objectif Corrections optiques Ab ti hé i Pas de milieu Nécessite de d immersion Aberrations sphériques Aberrations chromatiques Grandissement Ouverture numérique À sec ou à immersion Méthode éh de contraste Longueur du tube optique Épaisseur du couvre objet Distance de travail l huile à immersion Huile à immersion Permet meilleures Résolution et luminosité L ouverture numérique effective d un système se calcule l avec l IR le plus faible rencontré dans le trajet lumineux (air?) n air = 1,0003 Perte de rayons n huiledf = 1,5150 Tous les rayons sont captés Réfraction Réflection 31

32 Huiles à immersion Caractéristiques: Indice de réfraction (de 1,47 à 1,52) Viscosité Varie selon la température (23 o C à 37 o C) Attention aux additifs des fabricants Certaines contiennent des solvants pour huile séchée Ne pas mélanger les marques Ne pas utiliser une huile Zeiss sur un microscope Nikon Description d un objectif Corrections optiques Aberrations sphériques Aberrations chromatiques Grandissement Ouverture numérique À sec ou à immersion Méthode de contraste Longueur du tube optique Épaisseur du couvre objet Distance de travail Épaisseur du couvre-objet à utiliser pour obtenir la meilleure netteté d image ici: lamelle de 0,17 mm 32

33 . Qu est ce qu un couvre objet? «Ce qui recouvre le spécimen» Partie du support/contenant se trouvant entre le spécimen (objet) et l objectif Sur un Microscope droit Utilisés sur un Microscope inversé Lamelle seulement lamelle lame fond d un Pétri Fond d une plaque multipuits Effet de l épaisseur de la lamelle sur la résolution de l image Lamelle de 0,17 mm (# 1,5) avec un objectif corrigé pour 0,17 mm Lamelle de 0,17 mm avec un objectif corrigé pour 020mm 0,20 33

34 Effet de l épaisseur de la lamelle sur l intensité du signal Intensité de l image vs épaisseur de la lamelle Intensité max ximale obtenue Marge/erreur dans l épaisseur de la lamelle (mm) Bague permettant de corriger pour différentes épaisseurs de couvre-objet Effet de l épaisseur de la lamelle sur l intensité du signal L image la plus fidèle du spécimen est obtenue au plan focal collé à la lamelle lame lamelle 34

35 Description d un objectif Corrections optiques Aberrations sphériques Aberrations chromatiques Grandissement Ouverture numérique À sec ou à immersion Méthode de contraste Longueur du tube optique Épaisseur du couvre objet Distance de travail Distance de travail en mm Distance de travail «WD» Distance entre l objectif et le dessus du couvre objet en mm WD: «Working distance» ELWD: extra longue distance de travail Plus courte que distance focale 10x WD 16 mm Lentille d objectif 100x 0.13 mm 35

36 Distance focale Distance entre l objectif et le plan au point (au focus) est fixe pour un objectif Est plus grande pour les petits grossissements Diminue avec l ouverture numérique 10x Lentille d objectif 100x Spécimen au focus Distance focale Permet d imager en profondeur en déplaçant l objectif de bas en haut Cependant cette profondeur est aussi limitée par la distance de travail Spécimen 10x > 130 µm Lentille d objectif 100x < 130 µm 36

37 Nouveaux contenants pour contrecarrer les distances de travail courtes Pétri régulier Pétri avec fond en lamelle de verre # 1,5 Limitée aux objectifs avec grande distance de travail (LWD) Max. 40x Permet usage d objectifs à haute résolution (courte distance de travail) 40x et plus (NA 0.75 et +) Distance parafocale Distance entre le haut de l objectif et le spécimen au point (au focus) Permet de maintenir la mise au point (focus) lorsqu on on change dobjectif d objectif En général, identique pour tous les objectifs d une même marque Exception: 60x /1.40 Nikon 10x Spécimen au focus 37

38 . Autres caractéristiques des objectifs Parafocalité Paracentralité Zeiss Leica Olympus 45 mm Distance parafocale Nikon 60 mm Les objectifs Nikon ne sont pas compatibles avec les microscopes des autres marques. Description d un objectif Corrections optiques Aberrations sphériques (Planéarité) Aberrations chromatiques Grandissement Ouverture numérique À sec ou à immersion Méthode de contraste Longueur du tube optique Épaisseur du couvre objet Distance de travail Méthode de contraste DIC : Nomarski 38

39 Méthodes de contrastes Méthode Symbole Usage Restriction/désavantages Fond clair (brightfield) A, H Cellules et tissus colorés Manque de contraste pour spécimen incolore Fond noir (darkfield) D Objets biréfringents Faible ouverture numérique seulement Contraste de phase Ph Spécimen mince Tapis cellulaire monocouche Mauvais pour spécimen épais et/ou très réfringent Réduit la luminosité Réduit l illumination en fluo Contraste interférentiel différentiel (DIC) Nomarski (verre) Hoffman (plastique) DIC Spécimen épais Spécimen réfringent Tapis cellulaire Meilleure résolution en xyz Pas de halo Réduit la luminosité Comparaison entre Contraste de phase et DIC Illumination en fluo. Ph DIC 39

40 Contraste Interférentiel Différentiel Pseudo 3D Nomarski Microscopie et qualité de l image Caractéristiques Effet Correctif Indice de réfraction Réfraction Tenir compte de l épaisseur des matériaux Déviation de lumière du couvre-objet et bien choisir le milieu de montage Composantes à l intérieur d un objectif Lentilles grossissantes sont convexes Les couleurs ont différentes longueurs d onde Ouverture numérique Numerical aperture (NA) Ouverture numérique (NA) et grossissement (M) Transmitance Aberrations sphériques (le pourtour est flou) Aberrations chromatiques (le plan focal diffère d une couleur à l autre) Pouvoir de résolution entre 2 points rapprochés Intensité du signal Attention certains matériaux absorbent certaines longueurs d onde et ne les transmettent pas! Ajout de lentilles correctrices: Objectif appelés «Plan» Ajout de lentilles correctrices pour ramener toutes les couleurs sur le même plan focal: Objectifs appelés «Apochromate» Pour la meilleure résolution, utiliser les objectif et condensateur ayant la plus grande ouverture numérique. L intensité du signal augmente avec la NA mais diminue avec le M. 40

41 La fluorescence Avantages de la fluorescence Contraste t élevé é des images (sur fond noir) i) Possibilité d observer des éléments de taille inférieure au pouvoir de résolution du microscope Vaste choix de sondes fluorescentes 41

42 Marquage fluorescent simple Protéines de fusion (GFP, panier de fruit) Avantages : Fonctionne en cellules vivantes Permet de suivre des protéines en temps réel Peut être utilisé en aval de promoteurs spécifiques Coûts relativement bas Désavantages : Nécessite des clonages et des transfections Artéfactde surexpression Souvent très susceptible au photo blanchiment Coloration (DAPI, tubulin tracker, MitoTracker ) Avantages : Fonctionne en cellules vivantes Plusieurs marqueurs spécifiques pour différentes organelles Certains marqueurs ont des propriétés différentes en fonction de l état de la cellule Désavantages : Coûts prohibitifs Stabilité Peut influencer le comportement de la cellule Indirect (Immunofluorescence, FISH, mfish) Avantages : Variété de fluorophores et de sondes élevée Coûts relativement bas Désavantages : Cellules fixées seulement Plus long à faire Artéfacts de fixation Catégories de fluorophores Classique (FITC, TRIC, Rhodamine) Première génération de fluorophores Très susceptible au photo-blanchiment photo-toxique Très peu utilisé de nos jours Sert à identifier les cubes filtres Protéique (GFP, RFP) Petite molécule (27 kda) (4 nm) Sensible au photo-blanchiment Faible photo-toxicité Permet des techniques en cellules vivantes très avancées (FRAP, FRET...) Nouvelle génération (Alexa, Dylight) Modification chimique des fluorophores classiques Plusieurs catégories avec des propriétés chimiques différentes (attention au agent de montage) Très petites molécules (0,6 nm) Très photo-stable Faible photo-toxicité Quantum dots Petites molécules semi-conductrices (15-20 nm) Leur couleur est déterminée par leur grosseur (petit = bleu, gros = rouge) Très brillant Très photo-stable et non toxique Spectre d émission souvent très large 42

43 Protéines fluorescentes de fusion Photoblanchiment Perte de fluorescence d une molécule par Longue exposition à sa longueur d onde d d excitation ti Remèdes: Ajouter des filtres de densité neutre pour diminuer l intensité lumineuse d excitation Éviter l exposition aux UV Commencer les acquisitions avec les longueurs d onde de plus faible énergie (du rouge au bleu) Utiliser des milieux de montage avec «antifade» 43

44 Photoblanchiment à différentes vitesses selon les fluorophores Temps Temps Remède au photoblanchiment Antifade dans le milieu de montage Exemple Prolong gold, Mowiol 44

45 Préparation des échantillons À quoi faire attention? Éviter les aberrations sphériques Travailler sur des cellules en santé Vérifier l autofluorescence Éviter les aberrations sphériques Mauvaise épaisseur de couvre-objet Changement d indice de réfraction dans le trajet lumineux Spécimen épais 45

46 Éviter les changement d indice de réfraction dans le trajet lumineux Air Verre Air Eau Verre Air Huile Verre Air IR air = 1,00 IR eau = 1,33 IR huile = 1,50 Verre vide Verre plein d eau Verre plein d huile Interaction de la lumière avec la matière La réfraction Indice de réfraction n = vitesse de lumière dans le vide vitesse dans milieu transparent 46

47 Montage de lame Milieux de montage solides Mowiol en fluorescence (I.R. 1,49) Milieu de montage liquides Tampons, milieu de culture (I.R. 1,33) Glycérol 40% à 100% ( I.R. IR 1,39 139à 1,47) Nécessitent lutage Lutage des lamelles Vernis: sèche vite mais Séquestration du signal «Quenching» VALAP (mélange 1:1:1 de Vaseline, lanoline et paraffine): plus inerte mais facilement plus épais 47

48 Vérifier l état de vos cellules Bonne adhérence? Même morphologie? Avant Après traitement Symptômes morphologiques d une cellule en mauvaise santé 48

49 Si les cellules vous font des grimaces après traitement, posez vous des questions! Fluorescence et Contrôle en lumière transmise Avant Après 49

50 Les cellules sont elles heureuses de votre traitement? Avant Après Effet d une protéine ou Étude sur la lyse cellulaire? 50

51 Autofluorescence Importance des contrôles sans marquage pour vérifier l autofluorescence Autofluorescence de l élastine Autofluorescence Sources spécifiques d autofluorescence (excitation) Radicaux aromatiques des acides aminés (UV) Nucléotides réduits de pyridine (UV) Flavines (UV, bleu) Chitine (spectre étendu) Chlorophylle (bleu, vert) Sources communes d autofluorescence Cellules mortes (spectre étendu) ou stressées Lipofuschines (UV, bleu) Certains fixateurs Verre des lentilles d objectif (contenant du plomb) 51

52 Remèdes: Autofluorescence Choisir de la lumière d excitation de moins grande énergie (grandes longueurs d ondes [rouge]) Éviter le stress Imager des cellules en bonne santé* * Apoptose naturelle: 5% des cellules d une culture en santé seront apoptotiques Fixateurs utilisés en fluorescence Dénaturant (coagulant) (Éthanol, Méthanol, Acétone) Précipite les protéines Perméabilise les cellules Dénature les structures cellulaires Dénature la structure des épitopes Expose certains épitopes cachés Peut désactiver les GFP Augmente la pénétration des marqueurs dans les tissus Agents pontants (Para formaldéhyde) Garde la structure 3D Fixe les lipides Peut inhiber la perméabilisation Conserve la structure des épitopes Masque certains épitopes Possède une autofluorescence 52

53 Attention à l âge de la PFA Vieille paraformaldéhyde (PFA): Préparée depuis plus d une semaine Non conservée à 4 o C Non conservée à l abri de la lumière PFA dénaturée Vieille PFA = bonne séquestration du signal! «Quencher» Perte de fluorescence Microscopie et imagerie De quoi avons nous besoin? Un microscope de haute gamme Une caméra numérique CCD Un ordinateur pour l imagerie pour acquérir et emmagasiner les images, Logiciel d acquisition extraire les données à partir des images, Logiciels de traitement d images analyser le grand nombre de données Serveur Bio-imagerie et Bio-informatique 53

54 Imagerie quantitative Quelles données devront être extraites des images? Mesures morphométriques, 2D ou + Colocalisation de protéines Pourcentage de transfection Tracé des mouvements d une particule Ratio des interactions moléculaires (FRET) Coefficient de diffusion d une substance (FRAP) Reconstruction 3D Imagerie quantitative Choisir la méthode d acquisition d images 2D (xy), 3D (xyz), 4D (xyzt), 5D (xyztλ)? Fond clair, Nomarski, contraste de phase, fond noir? Multicouleur selon quelle méthode de colocalisation? Méthodes avancées (FRAP, FRET, FLIM, BRET )? Choisir le(les) détecteurs/caméras Caméras ou tube photomultiplicateur (PMT)? Couleur ou monochrome? Haute résolution? Haute vitesse? Grande sensibilité? UV ou IR? 54

55 imagerie quantitative Quels traitements d images devront être effectués? et quelles images ne devront pas manquer rendu à cette étape! Pour: Soustraction du bruit de fond (background) Calibrations (µm, intensités ité lumineuses) Déconvolution (PSF) Masques d échantillonnage (2 e coloration?) Microscopie et imagerie Comment présenter les résultats? Normes des éditeurs de publications Quelles images doit on conserver Attention aux transformations de format (éviter jpg) Éthique en imagerie Faites la manchette! Publication de Franck Gallardo, doctorant en BCM FISH sur levures S. cereviciae 55

56 Éthique en imagerie Les images sont des données Toujours conserver l image originale Travailler sur une copie Toujours comparer des images acquises et manipulées de la même façon Ne pas modifier partiellement une image Conserver toute l histoire d une image modifiée (les traitements effectués et dans quel ordre) Noms des fichiers Compatibles à Windows, Mac, Linux, Unix Pas d espace dans le nom Aucun accent sur les lettres (pas de é ê è à ) Pas de cédille Pas de signe tels que: \/: $ %?! «@ & * #» Pas de point autre que celui juste avant l extension (exemple dextension: d extension:.tif ) Sont permis: _ 56

57 Une image Contient une tonne de données Des bonnes: le signal Des mauvaises: le bruit L acuité des mesures dépend du rapport signal/bruit «SNR: Signal to Noise Ratio» Formation de l image = signal + bruit CCD photons électrons Chiffres (données binaires) Image numérique 57

58 Les bruits à l acquisition d image Du microscope: lumière ambiante réfléchie, réfractée, é diffractée Autofluorescence des lentilles, du montage Convolution de l optique (aberrations) De la caméra CCD (transformation ADU) Mode de détection: «Read out noise» Défauts du chip: «hot pixel» «darkcurrent» Perte du vide: Ronds de condensation De la carte graphique et de l ordi: délais de lecture, écriture et synchronisation Usage de la caméra CCD Influence des paramètres d acquisition sur l image Sous exposition et sur exposition Pixel, résolution et binning Critère de Nyquist (2,3 pixels/objet d intérêt) Sous échantillonnage et sur échantillonnage 58

59 Choisir un temps d exposition pour obtenir la plus grande plage d intensité ( dynamic range ) La meilleure plage dynamique doit être obtenue dès l acquisition. Le faire après ne pourra pas ajouter l information manquée/perdue. Cellules épithéliales en fond clair Sous et Sur expositions Sous exposition Surexposition 59

60 Sous et Sur expositions?? Résolution et binning Le nombre de pixels dans l image doit être suffisant pour distinguer les objects d intérêt: 60

61 Effets du binning sur la résolution Binning Aire de chaque pixel de l image (pixel 2 ) Nombre de pixels dans l image x x x x x136 Résolution de l image Meilleure Pire Binning et temps d exposition Binning Aire de chaque pixel de l image (pixel 2 ) Temps d exposition pr même intensité de signal (ms) Photoblanchiement Phototoxicité Qualité de l image Plus élevé Meilleure? faible Pire? 61

62 Sous et Sur échantillonnages Sous échantillonnage ORIGINAL Suréchantillonnage Sous échantillonnage Pixellisation (Aliasing): Distortion introduite lorsqu une image de haute résolution est échantillonné par un détecteur de plus basse résolution. 62

63 Suréchantillonnage Moiré: Distortion introduite lorsqu une image de basse résolution est échantillonné par un détecteuravec une trop haute résolution. Échantillonnage selon le critère de Nyquist Estimé de la grosseur de pixel requis pour obtenir les meilleures détection et résolution 550nm) Grossissement (Ouverture numerique) Limite de résolution (microns) Taille projetée sur CCD (microns) Grosseur min. requise pour le pixel (microns) 4X (0.20) (0.45) (0.75) (0.85) (1.30) (0.95) (1.40) * 100 (0.90) (1.25) (1.40) Combinaison parfaite pour la CoolSnap fx Critère de Nyquist: 2,3 pixels pour couvrir le plus petit objet d intérêt Ref Photometrics 63