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1 TP SPETROPHOTOMETRIE Lycée F.BUISSON PTSI pka D UN INDIATEUR OLORE ) Principes de la spectrophotométrie La spectrophotométrie est une technique d analyse qualitative et quantitative, de substances absorbant un rayonnement électromagnétique de longueur d onde comprise entre 300 et 900 nm avec le type d appareil utilisé. Lorsqu une substance absorbe dans le domaine du visible (400 nm <! < 700 nm), l œil ne perçoit en regardant cette substance, que les radiations non absorbées, c est pourquoi celle-ci apparaît colorée, de la couleur complémentaire à celle de la radiation absorbée..) Principe Soit un faisceau parallèle de lumière monochromatique (de longueur d onde! ) d intensité P0 traversant une solution absorbante de concentration sur une longueur de cuve de cm. L intensité du faisceau émergeant est P. On définit la transmittance par:

2 On définie l absorbance de la façon suivante :.2) Loi de Beer-Lambert Elle permet de déterminer A grâce à la relation empirique suivante : A =! ()! : concentration ( mol.l - ) dans un solvant non absorbant ou dont l absorption est compensée.! : coefficient d extinction molaire du soluté.! : longueur de la cuve (cm).! dépend de la substance absorbante, de la longueur d onde du faisceau! et de la température. La loi de Beer-Lambert est une loi limite, valable si la solution est diluée et si on se place à une longueur d onde proche du maximum d absorption..3) Loi d additivité des densités optiques Dans le cas de mélanges homogènes dilués, les densités optiques des différentes espèces contenues sans le mélange sont additives A =!!! i i. Le solvant est souvent lui-même absorbant. Pour connaître l absorbance d un soluté, il faut compenser l absorbance du solvant en réglant le «zéro» de l appareil. Par la suite, on notera absorbance ou densité optique d une espèce, la valeur de l absorbance due uniquement à la contribution de cette espèce (absorbance totale diminuée de l absorbance du solvant)..3) Utilisation du spectrophotomètre L appareil comprend : Une source lumineuse (lampe à iode) Un dispositif optique (prisme ou réseau) permet de sélectionner une longueur d onde, afin de disposer d un faisceau quasi monochromatique. Après avoir traversé une cuve contenant le solvant seul ou la solution étudiée, le faisceau arrive sur une cellule photoélectrique permettent de mesurer l intensité lumineuse émergente. Il est préférable de tenir les cuves par l extrémité supérieure afin de ne pas laisser de traces de doigts sur la partie traversée par le faisceau lumineux. Les cuves doivent être remplies avec précaution afin d éviter la formation de bulles. On les essuie avec du papier Joseph avant de les introduire dans le porte-cuve. 2) Vérification de la loi de Beer-Lambert On dispose d une solution colorée de concentration 0 = 5! 0 4 mol.l - i de KM n O 4. A l aide d une fiole jaugée de 50 ml et des pipettes disponibles, réaliser des solutions diluées de concentration 0 /2, 0 /5 et 0 /0. Sachant que l on a besoin seulement de quelques ml de chaque solution pour effectuer une mesure d absorbance, on peut prélever une fraction de solution diluée pour réaliser une solution encore plus diluée. 2

3 En vous plaçant au maximum d absorption de la substance colorée, indiquée sur le flacon de la solution initiale, mesurer les absorbances des 4 solutions de concentration différentes. Vérifier ainsi la loi de Beer-Lambert. 3) Détermination du pka d un indicateur coloré 3.) Principe L indicateur coloré est le bleu de bromothymol (BBT) qui est jaune en milieu acide et bleu en milieu basique. InH (aq ) + H 2 O (!) = In! (aq ) + H 3 O + (aq ) K a InH (aq) et In! étant de couleurs différentes, présentent des spectres d absorption (aq) différents, dont l allure à même concentration est la suivante (on représente en pointillé le spectre d un mélange des deux substances InH (aq) et In! tel que! InH (aq) +! In% = ). Formule éclatée et Modèle 3D de la molécule du Bleu de bromothymol de pka! 6,8 Soit un mélange de InH (aq) et In! (aq) indicateur coloré avec! InH de In! (aq). tel que InH! +! In% =, la concentration totale en = ( % x) et In! % = x avec par définition x la fraction molaire La détermination du rapport se fait à partir des valeurs des absorbances des trois solutions suivantes, pour une longueur d onde donnée. 2 3 BBT à ph connu (7,2) verte Les deux formes colorées présentes le sont à des concentrations molaires du même ordre de grandeur. [HIn] + [In ] = Absorbance A BBT à ph = solution jaune [In ]<<[HIn] Forme majoritaire : HIn [HIn]2 Absorbance A2 BBT à ph = 4 solution bleue [HIn] << [In ] Forme majoritaire In [In ]3 Absorbance A3 3

4 3.2) Protocole opératoire! La solution mère de bleu de bromothymol est à g.l -.! La solution tampon de ph = 7,2 est obtenue en mélangeant 50 ml d'une solution d'hydrogénophosphate de sodium (2Na + + HPO 2- ) à mol.l - avec 50 ml d'une solution d'acide chlorhydrique à mol.l -. On a alors ph = pka du couple H2PO - / 4 HPO On prépare 00 ml de chacune des solutions. S S2 S3 Dans une fiole jaugée de 00 ml rincée avec le milieu tampon H2PO - / 4 HPO2-4, introduire 5 ml de la solution mère de BBT. ompléter avec la solution tampon, homogénéiser. On obtient une solution verte S dont le ph est de 7,2. Dans une fiole jaugée de 00 ml rincée avec de l'acide chlorhydrique à 0, mol.l -, introduire 5 ml de la solution mère de BBT. ompléter avec la solution d'acide chlorhydrique et homogénéiser. On obtient la solution jaune S2 dont le ph. Dans une fiole jaugée de 00 ml rincée avec une solution de soude à mol.l -, introduire 5 ml de la solution mère de BBT. ompléter avec de la soude et homogénéiser. On obtient la solution bleue dont le ph 4. Pour chacune des trois solutions, on trace le spectre d'absorption A = f (!) à l'aide du spectrophotomètre. On superpose les trois spectres: les résultats obtenus se trouvent sur la page suivante. Remarque: Le blanc réactif est fait en prenant pour S la solution tampon ph =7,2 ; en prenant pour S2, l'acide chlorhydrique 0, mol.l - ; en prenant pour S3, la soude mol.l ) Exploitation des graphes obtenus pour le calcul du pka du BBT Nous choisirons deux longueurs d'onde λ et λ' de part et d'autre du point d intersection des trois courbes, appelé point ISOBESTIQUE, et nous appliquerons la loi de Lambert-Beer à chacune des trois solutions.! Pour λ : A = εhin l [HIn] + εin- l [In - ] A2 = εhin l [HIn]2 A3 = εin- l [In - ]3 d'où A = A2 soit :! Pour λ' : A3 [HIn] + [In- ]! A = A2 A3 A2 [HIn] + ( - [HIn] )! A = [HIn] ( - A3 ) + A3!HIn = A % A 3 A 2 % A 3 A' = εhin l [HIn] + εin- l [In - ] A'2 = εhin l [HIn]2 A'3 = εin- l [In - ]3 d'où A' = A'2 A'3 [HIn] + [In- ]! A' = A'2 ( - [In- ] ) + A'3 [In- ] 4

5 ! A' = [In - ] ( A'3 - A'2 ) + A'2 soit : In!! Au final : % = A ' '! A ' ' A 3! A 2 In! % & = A ' '! A ) & ( ' ' +, A! A ) 3 ( + HIn % A ' 3! A 2 * ' A 2! A 3 * Or ph = pka + log [In- ]! pka = ph - log [In- ] soit : [HIn] [HIn] pk a = ph! log A ' '! A A! A & 2 3 % ' ' ( A 3! A 2 A! A 3 ' A' 3 A 2 A A' S 3 A 3 S A' 2 S 2!! ' Déterminer le pk a du BBT. 5

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