Module 5 La maturation de l ARN et le contrôle post-transcriptionnel chez les eucaryotes

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1 Module 5 La maturation de l ARN et le contrôle post-transcriptionnel chez les eucaryotes Où trouver l'information complémentaire? MCB -11, GVII-5, 22, 23. La maturation des ARNm chez les eucaryotes Les hnrnp et l'arn hétérogène (hnrna) Le produit initial de la transcription par l'arn pol II, le transcrit primaire, subira plusieurs modifications avant d'être exporté du noyau vers le cytoplasme. Ce transcrit se retrouve associé à de multiples protéines dans le noyau, sous la forme de hnrnp (heterogenous nuclear ribonucleoprotein particle). Le transcrit primaire est aussi appelé hnrna (heterogenous nuclear RNA). Les protéines formant le hnrnp se lient à l'arn avec une grande affinité et une grande spécificité. Tout comme pour les facteurs transcriptionnels, les protéines des hnrnp possèdent une architecture modulaire, ayant un ou plusieurs domaines de liaison à l'arn de même que des domaines d'interaction avec d'autres protéines. Quoiqu'il y ait peu d'évidences expérimentales, plusieurs rôles peuvent être associés aux protéines hnrnp. Elles empêcheraient la formation de structures secondaires de façon à ce que l'arn puisse interagir avec d'autres macromolécules, une fonction similaire à celle des Ssb (single strand binding protein) pour l'adn lors de la réplication. Des évidences supportant cette fonction proviennent d'expériences d'hybridation entre ARN complémentaires où la présence des protéines hnrnp accélère la vitesse de réassociation (fig MCB). Elles auraient aussi un rôle dans l épissage des exons. Certaines protéines hnrnp vont et viennent entre le compartiment nucléaire et le cytosol, impliquant ces dernières dans le transport des ARNm. 1 Survol des différentes maturations que subit un messager eucaryotique durant sa transcription dans le noyau. Fig MCB La coiffe en 5' La première modification affectant les transcrits primaires des eucaryotes est l'addition d'une coiffe en 5' (5' cap). La coiffe en 5' est formée par l'ajout d'une guanosine (G) dans une liaison inhabituelle 5' 5', immédiatement après le début de la transcription (fig et 11.8 MCB). Une enzyme localisée dans le noyau, la guanylyl transférase, catalyse l'ajout de la guanine alors qu'une guanine-7-méthyltransférase ajoute un groupement méthyl en position 7 pour former la 7-méthyl-guanosine (m 7 G) (fig GVII). La coiffe est impliquée dans la protection du messager contre la dégradation, dans l'initiation de la traduction (la coiffe est reconnue par le facteur eif4f), de même que dans le transport des ARNm vers le cytoplasme. Pour les messagers d'eucaryotes unicellulaires, seule la m 7 G est produite. Une fois dans le cytoplasme, d'autres méthylations pourront se produire de façon à donner une coiffe de type m 2,2,7 G. La méthylation additionnelle de la coiffe m 2,2,7 G se

2 produit sur les deux premiers nucléotides, en position 2' du ribose, et non pas sur la guanine, qui n'est méthylée qu'une seule fois (fig GVII). L'implication de la coiffe dans le transport des ARN vers le cytoplasme a été démontré sur les petits ARN nucléaires (snarn) impliqués dans l'épissage des introns. Les snarn U1, U2, U4 et U5 sont synthétisés par l'arn pol II et possèdent une m 7 G en 5'. Ils sont exportés vers le cytoplasme où ils sont assemblés en snrnp et retournent au noyau. Le snarn U6 est syntétisé par l'arn pol III, ne possède pas de coiffe et n'est pas exporté vers le cytoplasme. Si l'on place maintenant dans une construction d'adn le gène U1 sous le contrôle du promoteur de U6 (pol III), non seulement ne possèdera-t-il pas de coiffe, mais il ne sera pas exporté vers le cytoplasme. 2 La polyadénylation des ARNm Dans les cellules eucaryotiques tous les ARNm, à l'exception des ARNm codant pour les histones, possèdent une queue de poly (A) à leur extrémité 3'. La queue de poly (A) n'est pas codée dans le génome et elle est produite de façon post-transcriptionnelle par un clivage endonucléolytique au site de polyadénylation. Ce site est généralement précédé d'une séquence de reconnaissance dont la séquence consensus est AAUAAA et située environ de 10 à 35 pb en amont du site de polyadénylation. Le clivage endonucléolytique produit une extrémité 3' OH qui servira d'amorce à la poly- A-polymérase (PAP) pour la synthèse d'une queue de 200 à 250 adénosines (fig MCB). Le mécanisme qui contrôle la longueur de la queue de poly (A) est inconnu. La queue de poly (A) tant des hnarn que des ARNm est liée par une protéine, la PABP (poly (A)-binding protein) pour les ARNm et la PABII pour les hnarn. Un monomère de PABP se lie à tous les 10 à 20 A. L'extension C-terminale de l'arn pol II, la queue CTD est importante pour l'épissage, la terminaison de la transcription et la formation de l'extrémité 3' de l'arnm mature. La queue CTD permettrait le recrutement des facteurs nécessaires au clivage du pré- ARNm après le signal de polyadénylation (AAUAAA). RNA pol II AAUAAA Terminateur ARNm SF CTD CStF 5' CPSF RNA pol II Terminateur 5' ARNm CPSF CStF AAUAAA CTD Adapté de Nature 385: , 1997 CPSF: cleavage and polyadenylation specificity factor CStF: cleavage stimulatory factor SF: splicing factor

3 La queue de poly (A) et la coiffe affectent la stabilité et la traduction des ARNm La quantité de protéines produites à partir d'un ARNm dépendra entre autres choses de sa longévité dans la cellule, ou autrement dit, de sa stabilité. L'ARNm devra donc être protégé contre l'action des exonucléases présentes dans la cellule et qui auront pour rôle d'éliminer les ARNm dont la cellule n'aura plus besoin. La coiffe et la queue de poly (A) sont deux barrières naturelles contre l'action des exonucléases agissant dans la direction 5' 3' ou 3' 5'. Lorsque liée aux protéines PABP, il semble que la queue de poly (A) puisse protéger les messagers contre la dégradation. La polyadénylation initiale des ARNm est effectuée dans le noyau et comporte l'addition d'environ 200 adénine. Une fois dans le cytoplasme, la queue de poly (A) est graduellement dégradée. Par contre, des queues de taille inférieure à 30 A ne sont pas observées, suggérant que 30 A est la longueur minimale requise pour la stabilité des ARNm. L'élimination de la queue de poly (A) inhibe l'initiation de la traduction in vitro et l'absence de protéines PABP a le même effet in vivo chez la levure. La présence des PABP sur la queue de poly (A) est aussi postulée être capable de favoriser la réinitiation de la traduction en rapprochant dans l'espace la grosse sous-unité ribosomale après la terminaison de la traduction et une petite sous-unité liée au codon d'initiation du même ARNm (fig MCB). La présence d'une queue de poly (A) à l'extrémité 3' des messagers est une caractéristique bien utile puisqu'il sera donc possible de purifier les ARNm par chromatographie d'affinité sur une colonne remplie de billes couplées à un polymère d'oligo (dt) (fig MCB, 5.18 GVII). La présence des introns et l'épissage (le chap. 22 GVII est entièrement consacré à l épissage) La présence des introns fut mise en évidence par des expériences d'hybridation ARNm/ADN génomique visualisées par microscopie électronique. La présence de boucles dans l'adn génomique ne s'hybridant pas avec le messager correspondant permit d'émettre l'hypothèse qu'il y avait des régions qui ne se retrouvaient pas dans l'arnm mature, quoiqu'étant colinéaires dans le fragment génomique (fig MCB). La comparaison des séquences des ARNm (sous forme d'adnc) avec les séquences génomiques correspondantes a permis de découvrir qu'il y avait effectivement des régions non-codantes intercalées, qui séparaient les gènes en introns et en exons et qui devaient être enlevées des transcrits primaires avant leur exportation vers le cytoplasme pour y être traduits. Un gène typique de mammifère contiendra de 7 à 8 exons (donc de 6 à 7 introns) répartis sur 16 kb et produira un messager 2.2 kb. Le mécanisme par lequel les introns sont enlevés des transcrits primaires et par lequel les exons sont réunis s'appelle l'épissage (splicing). Le complexe ribonucléoprotéique (incluant plusieurs snarn) nécessaire pour effectuer ce travail est communément appelé le spliceosome. La localisation précise des introns par la comparaison des séquences des ARNm et de l'adn génomique correspondant a permis de dégager certaines régions conservées dans la séquences des introns (fig BMC). La bordure 5' de l'intron est presque toujours GU, alors que la bordure 3' est AG, d'où la règle GU-AG (ou GT- 3

4 4 AG lorsque l'on considère l'adn) des bordures des introns. On appelle aussi la bordure 5' (GT), le site donneur et la bordure 3' (AG), le site accepteur. Les nucléotides adjacents à GU et AG sont aussi plus ou moins conservés. De plus, entre la bordure 3' et l'adénine du site de branchement, on retrouve un région riche en pyrimidines. L'absence de complémentarité entre les extrémités des introns exclut un mécanisme simple d'épissage qui aurait passé par la formation d'une structure secondaire permettant de rapprocher dans l'espace les sites donneur et accepteur. L'analyse des intermédiaires de la réaction a permis de déterminer le mécanisme de l'épissage. L'excision de l'intron et la réunion des exons passent par deux réactions de transestérification (fig MCB et 22.6, 22.7 GVII). L'épissage peut être divisé en trois étapes: (1) Coupure de l'extrémité 5' par une attaque endonucléolytique de l'extrémité 2' OH du ribose de l'adénine du site de branchement sur le phosphate 5' de la guanine du site donneur GU. C'est la première transestérification. Ceci provoque la formation du lasso. Le premier exon est alors "libre", quoique toujours associé au spliceosome. Exon 1 2' OH O-P-O-GU...A...AG-O-P-O Exon 2 (2) Coupure de l'extrémité 3' par une attaque du groupement 3' OH libre de l'extémité du premier exon sur le groupement phosphate 5' de la première base du second exon. C'est la deuxième transestérification. Elle permet la ligation des 2 exons. L'intron avec sa structure en forme de lasso est alors libéré. Exon 1 OH O-P-O-GU A...AG-O-P-O Exon 2 (3) La liaison au site de branchement formant le lasso est alors coupée (débranchement) et l'intron redevient entièrement linéaire. L'intron est ensuite dégradé. Le site de branchement est assez bien conservé chez la levure (UACUAAC), alors que chez les eucaryotes supérieurs, il ne l'est pas, sauf pour une préférence assez nette pour une région se conformant à la suite Py 80 NPy 80 Py 87 Pu 75 APy 95 (où Py spécifie une pyrimidine, C ou U, et Pu spécifie une purine, A ou G). Le site de branchement est situé de 18 à 40 nt de l'extrémité 3' de l'intron. La mutation ou la délétion du site de branchement empêche la réaction d'épissage chez la levure. Le rôle du site de Exon 1 A...AG-OH 5'-GU...A...AG-3' O-P-O Exon 2 branchement semble donc celui de choisir l'extrémité 3' la plus proche qui servira à l'épissage et à sa ligation avec l'extrémité 5'. Le rôle des snarn durant l'épissage Les petits ARN nucléaires (snarn, small nuclear RNA) jouent un rôle primordial lors de l'épissage, soit celui de la reconnaissance des jonctions 5' et 3', de même que du site de branchement. Les snarn sont de petits ARN de 100 à 300 nt chez les eucaryotes supérieurs et certains atteignent 1 kb chez la levure. Ils se retrouvent O-P-O-GU

5 sous la forme de snrnp, c. à d. associés à des protéine spécifiques. Un snrnp contient généralement un snarn et 10 protéines associées. Le snarn U1 possède une région complémentaire au site donneur (l'extrémité 5'). Le snarn U2 possède une région complémentaire au site de branchement (fig MCB). Les snarn U4 et U6 s'apparient ensemble et forme un complexe avec le snarn U5. Le snarn U6 forme aussi un appariement différent cette fois avec le snarn U2 (fig GVII). Les snarn interagissent donc non seulement avec le pré-arnm, mais aussi entre eux, par la complémentarité de certaines de leur régions. L'interaction des snrnp avec l'intron suit une séquence stricte, mettant en évidence les interactions entre les différents snrnp (fig MCB, GVII). En plus des snrnp, le spliceosome est aussi constitué de plusieurs protéines additionnelles appelées facteurs d'épissage. On estime qu'une centaine de protéines au total participent à l'épissage ce qui rend ce processus d'une complexité comparable à l'initiation de la transcription ou la synthèse protéique. L'épissage alternatif La très vaste majorité des gènes possédant des introns sont transcrits en un seul type d'arnm dont tous les introns auront été épissés avant d'être exportés du noyau vers le cytoplasme. Certains gènes pourront par contre produire plusieurs ARNm différents par la combinaison de certains exons. C'est ce qu'on appelle l'épissage alternatif (alternative splicing). L épissage alternatif permet donc de produire divers ARNm, et donc, diverses protéines à partir d un même gène. De plus, l épissage alternatif peut assi servir de commutateur (switch, on/off) en introduisant, par exemple, un codon stop prématurément dans une protéine. Voyons l exemple de la détermination du sexe chez la Drosophile et du rôle de l épissage aletrnatif sur le gène Sex-lethal (Sxl). Fig MCB 5

6 Chez la Drosophile, le sexe est déterminé par le ratio X:A (ou le rapport X/A), où A correspond au jeu complet des autosomes (n=4, 3 autosomes et un hétérochromosome; Drosophile diploïde 2n). Un ratio X:A de 1 produit une femelle (XX AA). Un ratio X:A de 0.5 produit un mâle (XY AA). La première étape est la détermination par chaque cellule de l'embryon du ratio X:A, qui ➁ X:A = 1 (XX AA) Produit par le chromosome X (numérateur) Produit par les autosomes (dénominateur) Dimères actifs Dimères inactifs Dimères inactifs Les ➁ auront 2 fois plus d homodimères bhlh actifs que les ❹. ➁ X:A = 0,5 (XY AA) Produit par le chromosome X (numérateur) Produit par les autosomes (dénominateur) Dimère actif Dimères inactifs Dimères inactifs réflète la concentration de certains facteurs transcriptionnels de type bhlh (basic Helix-loop-Helix) codés sur le chromosome X. Le ratio X:A est évalué par l'interaction entre les facteurs transcriptionnels dits numérateurs (produits par les chromosomes X, fonctionnels) et dénominateurs (produits par les autosomes, non-fonctionnels car ne possédant pas de domaine de liaison à l'adn). Le facteur dénominateur, s'il est présent en trop grande quantité par rapport au facteur numérateur empoisonnera les complexes hétérodimériques formés. Seuls les homodimères numérateur-numérateur forment des facteurs actifs. L interaction prt-prt détermine donc la suite du développement. Si la concentration est suffisante, comme chez les femelles (XX AA), le gène servant de maître commutateur (master switch gene) déclenche une cascade d'événement menant à la formation d'une mouche femelle. Si la concentration est trop faible, le commutateur n'est pas enclenché et la voie de défaut (default pathway) est utilisée (mâle XY AA). La protéine Sxl (Sex-lethal) est une RNA binding protein qui sous l effet du ratio X:A n est produite que dans les embryons femelles (voir la fig MCB à la page précédente). L'action de Sxl est de permettre l'épissage alternatif de son propre ARNm et produire Sxl de façon constitutive dans les tissus des mouches femelles (➁) par une boucle d'autorégulation. La version de Sxl produite dans les mouches mâles (❹)contient un codon stop dans l'exon 3 qui rend la protéine non-fonctionnelle. Sxl influencera aussi l épissage du gène Tra (transformer). Comme il n y a pas de Sxl active produite dans les embryons mâles, la protéine Tra ne sera pas épissée correctement et produira chez les mâles une protéine Tra inactive. Donc, une fois la décision initiale prise (produire ou ne pas produire Sxl, that is the question!), celle-ci provoquera une cascade d événement en aval de Sxl pour produire le phénotype femelle. Maintenance Jeune embryon de Drosophile X:A=1 Sxl actif Tra actif ARN Dsx épissage ➁ Protéine Dsx ➁ Répression des gènes structuraux spécifiquement ❹ ➁ X:A=0.5 Sxl inactif Tra inactif ❹ 6 ARN Dsx épissage ❹ Protéine Dsx ❹ Répression des gènes structuraux spécifiquement ➁

7 Tra code aussi pour une RNA binding protein active uniquement dans les femelles. À son tour, Tra, de concert avec Tra2 influencera la production du messager mature de Dsx (double-sex). La protéine Dsx produite par épissage alternatif causée par Tra, sera un répresseur des gènes mâles dans les Drosophiles femelles. La protéine Dsx produite sans l'action de Tra produira un répresseur des gènes femelles dans les mouches mâles. Transport des ARNm vers le cytoplasme Après maturation complète, les ARNm sous forme de mrnp (ribonucléoprotéines) sont prêts à être exportés vers le cytoplasme via les 4000 pores nucléaires que l'on retrouve dans la membrane nucléaire (fig MCB). La double membrane lipidique qui entoure le noyau est une extension spécialisée du réticulum endoplasmique rugueux. Les pores nucléaires fonctionnent comme des canaux qui permettront le passage sélectif des mrnp vers le cytoplasme. Comme nous l'avons mentionné précédemment, la coiffe en 5' est importante pour le transport de mrnp. Il est de plus impératif qu'aucun ARNm non-entièrement épissé soit exporté vers le cytoplasme puisqu'il serait généralement traduit en une protéine non-fonctionnelle. La présence d'introns non-épissés provoquerait soit la modification du cadre de lecture, soit l'introduction de codons stop. Dans le cas d'introns ne produisant ni l'un ni l'autre des deux effets précédents, il y aurait possibilité d'obtenir une protéine dont la partie additionnelle, codée par l'intron, introduise une région déstabilisant la protéine ou inhibant l'activité de cette dernière. Les pré-arnm encore associés au spliceosome ne sont pas exportés vers le cytoplasme. Un pré- ARNm dont on aurait modifié le site donneur GU de l'un de ses introns ne serait pas transporté vers le cytoplasme. Il en est de même pour un pré-arnm dont le site accepteur AG aurait été modifié. Par contre, si les deux sites GU et AG ont été modifiés, l'intron ne sera pas reconnu du tout et le pré-arnm n'étant pas lié au spliceosome sera exporté, même s'il est défectueux. Les protéines hnrnp qui demeureront liées à l'arnm lors de son exportation vers le cytoplasme seront recyclées et retourneront par les pores nucléaires dans le noyau. D'autres protéines, cette fois cytoplasmique, s'associeront avec l'arnm, formant alors un mrnp. L'une de ces protéines sera la PABP (poly-a-binding protein) qui couvre la queue de poly (A) et qui est différente de celle qui couvre la queue de poly (A) dans le noyau (PABII) (fig MCB). Cette étape du transport sélectif des ARNm matures représente un autre site de régulation possible. Cette stratégie d'un transport préférentiel des messagers est utilisée par certains virus, dont l'adénovirus et le virus du Sida (HIV). Localisation des ARNm dans la cellule La traduction de plusieurs ARNm ne se fait pas au hasard dans le cytoplasme de la cellule. Dans certains cas, on pourra retrouver des ARNm spécifiques localisés en des endroits bien précis de la cellule. C'est le cas par exemple de l'α-actine et de la β-actine, dont la localisation est régulée par des séquences spécifiques dans la région 3' non-traduite de l'arnm (fig MCB). Plusieurs ARNm demeurent associés au cytosquelette de la cellule et cette liaison semble rendue possible par la liaison des PABP aux filaments d'actine du cytosquelette. 7

8 La stabilité des ARNm et son contrôle La concentration d'un messager dans une cellule ne dépendra pas uniquement de son taux de transcription, mais aussi de la stabilité du messager, c. à d. de sa persistance dans la cellule, donc de l'équilibre entre son taux de synthèse et son taux de dégradation. La dégradation des ARNm est un processus en deux étapes impliquant des endonucléases de même que des exonucléases (fig GVII). Une mesure utile est la demi-vie des messagers, soit le temps requis pour qu'il y ait disparition de 50% d'un messager. Dans le cas des ARNm procaryotiques, la demi-vie est très courte, de l'ordre de quelques minutes (2 à 10 min). Ceci permet à la cellule de réagir rapidement aux changements de son environnement. Puisque la 1/2 vie des ARNm procaryotiques est courte, le contrôle majeur sera au niveau transcriptionnel. Dans le cas des messagers eucaryotiques, la demi-vie varie beaucoup d'un messager à l'autre, la demi-vie moyenne étant d'environ 10 heures (Table 11.1 MCB). À la régulation transcriptionnelle viendra donc s'ajouter d'autres niveaux de régulation, comme la durée de vie des ARNm, la traduction préférentielle de certains ARNm et la modification post-traductionnelle des protéines. Certains ARNm eucaryotiques ont des 1/2 vie très courtes et ceci semble régulé par la présence de séquences déstabilisantes spécifiques, telle la séquence AUUUA présente en plusieurs copies dans la région 3' non-traduite de certains ARNm à 1/2 vie réduite (fig MCB). 8 Endonucléase Exonucléase Les mécanismes régulant la stabilité d'un ARNm sont en général fort peu connus. Chez la levure, deux mécanismes régulant la dégradation des messagers ont pu être identifiés (fig GVII). L'un est dit dépendant de la déadénylation, donc de la perte de la queue de poly (A); l'autre est indépendant de la perte de la queue de poly (A). Dans les deux cas, une étape cruciale est la décapitation, dans le contexte présent, la perte de la coiffe (cap) en 5'. Le messager ainsi "décoiffé" présente son extrémité 5' non-protégée maintenant accessible aux exonucléases maraudant dans le cytoplasme (on se croirait en plein tournage d'un film médiéval!). Que préfère l exonucléase? La réponse à la fin du module! 5' 3' Un exemple où le contrôle de la stabilité a été bien étudié est celui des messagers codant pour le récepteur de la transferrine (TfR). La transferrine (Tf) est une protéine impliquée dans le transport du fer dans la circulation sanguine. Sans la transferrine, la quantité d'atomes de fer pouvant pénétrer dans une cellule serait trop faible, car le fer est très peu soluble (essayez de manger une vieille boîte de conserve pour voir si c est soluble!). Le complexe fer-transferrine est reconnu par un récepteur spécifique à la surface des cellules. Quand la quantité de fer est suffisante dans la cellule, l'importation du complexe transferrine-fer est réduite en augmentant le taux

9 de dégradation du messager du récepteur de la transferrine, ce qui a pour effet de réduire le nombre de récepteurs. L'analyse par délétions du gène TfR a permis de caractériser certaines régions du messager TfR, nommées IRE (Iron-Responsive Elements/éléments de réponse au fer) dans la région 3' non-traduite de l'arnm TfR. Chaque IRE est 30 nt et peut former une structure tigeboucle. La boucle contient 5 nt spécifiques qui seront reconnus dans cette conformation par une protéine cytoplasmique, la IRE-BP (Iron Responsive Element Binding Protein, ou aconitase). La tige, quant à elle, est faite de séquences riches en AU similaires à la séquence AUUUA. Quand la concentration en fer est faible, il y a liaison des IRE-BP à la structure tige-boucle, ce qui empêche la reconnaissance des séquences déstabilisantes AUUUA (fig MCB). Quand la concentration cellulaire en fer est suffisante, la protéine IRE-BP lie elle-même le fer et ne peut plus se lier à ces régions. Ces régions riches en AU agissent alors de la même façon que pour les ARNm dont la 1/2 vie est très courte (voir ci-haut). La protéine IRE-BP est donc sous contrôle allostérique, le fer étant ici l'effecteur. La maturation des ARNr chez les eucaryotes Environ 80% des ARN totaux dans une cellule sont des ARNr. Les ARNr 28S et 5.8S associés à la grosse sous-unité ribosomale (60S), de même que l'arnr 18S associé à la petite sous-unité (40S) sont transcrits par l'arn pol I, sous la forme d'un long précurseur de 45S d'une longueur de 13.7 kb chez les eucaryotes supérieurs. Ce transcrit primaire doit alors être maturé pour libérer ses composantes individuelles (fig b MCB). La maturation implique, tout comme pour l'épissage, la présence de snarn, appelés des snoarn (sno pour small nucleolar) qui se retrouveront associés à des protéines pour former des snornp. En plus des maturations, le pré-arnr subit aussi plus de 100 méthylations sur des bases ou des riboses spécifiques. Ces modifications impliquent aussi des snoarn. La synthèse et la maturation des ARNr, de même que la formation des ribosomes s'effectuent au niveau du nucléole, une région discrète du noyau eucaryotique créée par la transcription des gènes d'arnr (fig a MCB; ne pas oublier l'organisation en tandem des unités de pré-arnr). Le pré- ARNr joue en fait le rôle d'organisateur nucléolaire. La présence du pré- ARNr "attire" les autres composantes nécessaires à la formation du ribosome. L'ARN 5S, qui fait aussi parti de la sous-unité 60S est quant à lui transcrit par l'arn pol III. La synthèse et la maturation des pré-arnr 5S a lieu dans le nucléoplasme et non pas au niveau du nucléole. Une fois synthétisé et maturé, l'arn 5S migre vers le nucléole où il est assemblé avec la sousunité 60S. 9

10 La maturation des ARNt chez les eucaryotes Les ARNt représentent environ 15% des ARN totaux d'une cellule et sont transcrits sous la forme d'un précurseur par l'arn pol III. Les ARNt cytoplasmiques contiennent de plus de nombreuses bases modifiées que l'on ne retrouvent pas dans le transcrit primaire. Certains ARNt contiennent même de courts introns, comme l'arnttyr de levure, qui contient un intron de 14 pb! Ces introns ne suivent pas la règle GT-AG et les exons sont épissés par un mécanisme différent de celui opérant chez les pré-arnm. Les pré-arnt comportent tous une extension en 5' de longueur variable qui sera enlevée par la ribonucléase P (RNase P), une enzyme ribonucléoprotéique. En plus de l'épissage et du clivage en 5', 10% des bases des pré-arnt sont modifiées enzymatiquement. Trois types de modification sont connus: 1) le remplacement de U à l'extrémité 3' par le triplet CCA que l'on retrouve chez tous les ARNt; 2) l'addition de groupement méthyl et isopentényl sur certaines purines et la méthylation de certains riboses; 3) la conversion de certaines uridines en dihydrouridines, pseudouridines ou ribothymidines (fig MCB). L'épissage en trans Nous avons vu précédemment que l'épissage opérait en cis, c. à d. que des régions contiguës, séparées par un intron et faisant partie du même précurseur, étaient liées ensembles (épissées) pour donner naissance au messager mature. Une autre forme d'épissage a été découverte chez des organismes tels les trypanosomes, certains protozoaires euglénoïdes et le ver Caenorhabditis elegans. Dans ce type d'épissage, l'un des exons, représentant la partie 5' de l'arnm mature, est ajouté à un autre exon. La particularité réside dans le fait que ces deux exons proviennent de deux unités transcriptionnelles différentes, d'où le nom d'épissage en trans (fig MCB, 3 ème éd.). Chez les trypanosomes, tous les ARNm possèdent un mini-exon en 5' ajouté par épissage en trans et qui semble important pour l'initiation de la traduction des ARNm. Plusieurs des unités transcriptionnelles chez ce protozoaire sont organisées sous une forme polycistronique, ressemblant de ce fait aux opérons bactériens. L'ajout en 5' de ce mini-exon sur chacun des cistrons permet la formation de messagers individuels monocistroniques à partir d'un précurseur plus long et à l'origine, polycistronique (voir aussi GVII, fig et 22.22). L'édition des ARN L'édition des ARN ou RNA editing fut découverte en comparant les séquences d'adn avec les ARNm correspondants de certains gènes mitochondriaux de protozoaires et de plantes, de même que chez certains gènes chloroplastiques. On y trouva des additions et des délétions importantes de séries de U. Ces additions ont lieu de façon post-transcriptionnelle et modifient extensivement l'arnm. Chez les mammifères, une forme d'édition de l'arn permet la production de deux protéines à partir du gène de l'apolipoprotéine B (apo-b). Dans les hépatocytes, la forme apo-b100 est exprimée, alors que dans l'épithélium intestinal, c'est la forme apo-b48. Les deux formes proviennent d'un seul et même gène et sont identiques de l'aa #1 à # La production de 10

11 ces deux formes ne passe pas par un épissage de type alternatif, mais plutôt par la modification post-transcriptionnelle d'un codon CAA en codon UAA dans le messager, produisant ainsi un codon de terminaison (fig MCB). Cette modification est produite par une enzyme (cytidine désaminase) qui reconnaît spécifiquement cette région et enlève le groupement amino en position 4 de la cytosine (désamination oxydative) pour la transformer en uridine. 11 La forme la plus impressionante d édition des messagers se retrouve chez les mitochondries de trypanosomes. Ces protozoaires parasites possèdent une seule grosse mitochondries appelée kinétoplaste. Plusieurs des précurseurs d ARN sont extensivement modifiés soit par l addition de bases, soit par la délétion de bases de façon à rendre fonctionnel l ARN. La copie d ADN dans le génome du kinétoplaste est donc imparfaite et doit être corrigée pour produire un ARN et donc, une protéine fonctionnelle. Cette forme complexe d édition se retrouve chez les trypanosomes les plus primitifs et pourrait représenter une relique moléculaire (un fossile!) de la machinerie de synthèse des ARN durant une phase précoce de l évolution de la cellule. Comme l ADN codant pour ces gènes n est pas fonctionnel sans les modifications apportées à l ARN, la machinerie d édition a été conservé au cours de l évolution de ces organismes. Les modifications sur le transcrit primaire nécessitent un ARN guide qui va s apparier aux régions à modifier par complémentarité et guider le complexe d édition. Burp! 3' 5' L exonucléase préfère une extrémité libre, 5 ou 3, relish, moutarde, ketchup!