sporozoïtes Oocystes* Schizontes* ookinètes mérozoites zygotes Développement : Durée de la sporogonie (à 28 C, en jours)

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1 500 Nombre de cas de paludisme diagnostiqué en Belgique LA MALARIA : Nombre de cas Méthodes diagnostiques Année LA MALARIA fr 2006 ver pg 01 Sur base des données fournies par les 121 laboratoires vigies du réseau de surveillance des maladies infectieuses, soit 51 % des laboratoires agrées en 2002 pour la microbiologie. (Ministère des Affaires Sociales, de la Santé Publique et de l'environnement. Institut Scientifique de la Santé Publique-Louis Pasteur EPH / EPI REPORTS, Nr ). Sur base de ces données, on estime le nombre de total de cas à environ 500 par an pour la Belgique. Anophèles Hommes * = multiplication Anophèles Hommes * = multiplication sporozoïtes Repas sanguin sporozoïtes Repas sanguin Oocystes* GLANDES SALIVAIRES HEMOLYMPHE schizontes hépathiques* Oocystes* GLANDES SALIVAIRES HEMOLYMPHE schizontes hépathiques* Schizontes* Schizontes* ookinètes mérozoites GLOBULES ROUGES ookinètes mérozoites GLOBULES ROUGES zygotes ESTOMAC gamétocytes formes en anneaux ou trophozoites zygotes ESTOMAC gamétocytes formes en anneaux ou trophozoites macro & microgamètes Repas sanguin GLOBULES ROUGES macro & microgamètes GLOBULES ROUGES Primaquine Repas sanguin (Artéméther) Fansidar P. falciparum P. malariae P. ovale P. vivax Seuil clinique 1000 Parasites /µl 100 Seuil de patence 10 1 période prépatente Modalités d évolution de la parasitémie incubation Effet Traitement suppressif Traitement radical < 0, schizogonie hépatique inoculation rechute ou réinfection recrudescence de l immunité parasitémies asymptomatiques Temps (en jours) parasitémies subpatentes Développement : Durée de la sporogonie (à 28 C, en jours) Durée de la phase hépatique (en jours) Durée du cycle érythrocytaire (en heures) Périodicité Période pré patente (en jours) Incubation (en jours)[moyenne] Apparition des gamétocytes (en jours) Hypnozoïtes Distribution géographique : Afrique du Nord Afrique occidentale Afrique centrale Afrique orientale Madagascar, Océan Indien Amérique centrale Amérique du Sud Asie du Sud-ouest Inde, Indochine Indonésie Iles du Pacifique fièvre tierce maligne [12] 8-15 non fièvre quarte [10] 5-23 non fièvre tierce bénigne oui Très rare - Malaisie, Philippines fièvre tierce bénigne [14] 5 oui Très rare Très rare 1

2 Répartition des espèces (n= 262) pour les cas de paludisme diagnostiqués 11% 10% en 1998 en Belgique 2% 0% 0% Répartition des espèces (n= 210) pour les cas de paludisme diagnostiqués en 2002 en Belgique 1% 10% 4% 77% 85% P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae P. falciparum + P. ovale P. falciparum + P. malariae P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae Sur base des données fournies par les 121 laboratoires vigies du réseau de surveillance des maladies infectieuses, soit 51 % des laboratoires agrées en 2002 pour la microbiologie (données recorrigées par le laboratoire de référence). Le laboratoire de référence a reçu en échantillons pour confirmation, soit 62,5 % des cas (en décomptant les 123 cas diagnostiqués directement par le laboratoire de référence). Il est à remarquer que les demandes de confirmation sont en baisse constante depuis 5 ans. Cette baisse de 77,0 % des cas en 1998 à 62,5 % des cas en 2002, devrait être liée à l introduction de tests de détection des antigènes de Plasmodium. (Ministère des Affaires Sociales, de la Santé Publique et de l'environnement. Institut Scientifique de la Santé Publique-Louis Pasteur EPH / EPI REPORTS, Nr ). Diagnostic du paludisme : 6. Détection D d une d infection par les automates hématologiquesh 1. [Diagnostic clinique ] 2. Détection des parasites (microscopie). 3. Détection des antigènes nes parasitaires. 4. Détection de matériel génétique g (ADN ou ARN) parasitaire (PCR). 5. Détection d anticorps d dirigés s contre le parasite. 6. Détection d une d infection par les automates hématologiques] Altération du volume cellulaire Pigment malarien (dépolarisation) 6. Détection d une d infection par les automates hématologiques h : ADVANTAGES Automatisé. En même temps que le comptage différentiel. DESADVANTAGES Quantification Équipement. Sensibilité Spécificit cificité Différentiation des espèces? Pre-Screening pour patients non (peu) suspects 5. Détection D d anticorpsd Détermination possible d anciennes infections guéries (diagnostic rétrospectif). r Utilité dans le cadre des néphropathies malariennes. Utilité dans le cadre de la transfusion sanguine (zone non endémique). Ne détecte d pas les infections très s récentes. r Lent. Nécessite une expertise. Coûteux Négativation en 6 mois à 2 ans Pas pour diagnostic. C. Fourcade, M.J.C. Casbas, H. Belaouni, J.J.D. Gonzales, P.J.J. Garcia, M.A.E. Pepio (2004). Automated detection of malaria by means of the haematology analyser Coulter GEN.STM. Clin.lab.Haem. 26,

3 4. PCR (détection d ADN) d Sensible (jusqu à parasites/µl) Spécifique. Différentiation des espèces (pas toujours!). Détermination des infections mixtes. Délais pour lancer un «run». Lent. Coûteux. Contaminations. Équipement spécialis cialisé. Personnel spécialis cialisé. non disponible en dehors des heures (Quantification?). Pas pour diagnostic. 4. PCR USAGES (2) Étude de résistance r aux anti-malariques. Identification de nouvelles espèces infectant l homme l ( (P. knowlesi,...). Patient suspect de malaria avec GE répétées négatives n (ex. parasitémie basse après s un traitement partiel). Confirmation pour des infections mixtes. Confirmation de l espl espèce en cas de doutes microscopiques. 4. Real time PCR (3)? 3. Détection des antigènes nes parasitaires : HRP HRP-2 [Histidine Rich Protein-2, glycoprotéine produite et larguée e par les tes et les jeunes (pas si matures) gamétocytes de P. falciparum]. HRP-2 2 /aldolase/ (combinaison) [Aldolase Aldolase ou panmalarial antigens (PMA), présents dans les 4 espèces de plasmodium]. Avantage : idem + rapide. Inconvénients nients : idem + coûts ts pldh (combinaison) (combinaison) [Parasite Lactate DeHydrogenase produite par les formes sexuées es et asexuées es des parasites du paludisme. Distinction entre les iso-enzymes de pldh de P. falciparum et non falciparum]. HRP2/ pldh (combinaison) Tests Rapides malaria disponibles commercialement (1) (Cette liste n est n basée e sur aucun critère re de qualité des produits. Dernière re mise à jour 12/2005) Plasmodium Producteur Nom du test Sites Web détection ACON Laboratories Malaria P.f. Rapid Test Palutop+4 P.f., P.v., Pan. (HRP2, pldh) ALL DIAG Palutop AmeriTek, Inc. One Step Malaria Test P.f., P.v., Pan. (HRP2, NOW Malaria Binax Aldolase) Now P.f. casette Tests Rapides malaria disponibles commercialement (2) (Cette liste n est n basée e sur aucun critère re de qualité des produits. Dernière re mise à jour 12/2005) Plasmodium Producteur Nom du test Sites Web détection Hexagon Malaria Human GmBH Hexagon malaria Combi P.f., P.v., Pan. (pldh) International Immuno- One-Step Malaria (PF/PV) P.f., Diagnostics Kat-Medical KAT-Quick Malaria test Mega Diagnostics, Inc. MegaKwik Malaria (Pf) Card Test Visitect Malaria Omega Diagnostics Ltd. Visitec Malaria Combo Bio-Quant, Inc BQ023-A One Step Malaria Test Orchid Biomedical Systems Paracheck Pf Cellabs Pty. Ltd Core Diagnostics Ltd. Cortez Diagnostics, Inc. Cypress diagnostics DiaMed SA Flow Inc. Rapimal dipstick Rapimal cassette Malaria travellers kit CORE Malaria (Pf, Pf/Pv, Pan Pf) CORE Malaria (Pf) OneStep RapiCard InstaTest OneStep Malaria RapiDip instatest Malaria Quick Test Malaria Total Quick Test OptiMAL Rapid Malaria Test OptiMAL Rapid Malaria Test P.f., P.v., Pan. P.f., P.v., Pan. (pldh) P.f., P.v., Pan. (pldh) Plaza Diagnostics Premier Medical Corporation Princeton BioMeditech Corporation R & R Marketing SPAN Diagnostics Ltd. Standard Diagnostics Inc. Plaza Smart Chek Malaria Ag Tests First Response Malaria P.f / P.v Antigen Strips BioSign Malaria ICT Malaria test Cassette format ICT Malaria test Strip format ICT Malaria test Cassette format ParaHIT f SD Bioline Malaria Antigen SD Bioline Malaria Antigen POCT P.f., P.f., P.f., P.f., Genix Technology Malaria (P. fal.) Ag Trinity Biotech Rapid Uni-Gold Malaria (Pf.) Genelabls Diagnostics Ltd. ASSURE Malaria P.f. Rapid Test Vencor International Inc. DxStrip Malaria Combo Global emed, LLC Smartcheck Malaria F Malarai Combo Rapid Strip Smart Strip Malaria Test Zephyr Biomedical Systems Parascreen FalciVax ParaMax 3 / Para bank P.f., Pan. (HRP2, pldh) P.f., P.v. (HRP2, pldh) P.f., P.v., Pan. (HRP2, pldh) 3

4 Tests rapides : procédure généraleg HRP-2 Exemple : Parasight F SENSIBILITE : 96 % parasitémie > 100 P.f. / µl 80 % parasitémie P.f. / µl < 60 % parasitémie < 10 P.f. / µl SPECIFICITE : De l ordre l de 95 % Rapide (< 15 minutes). Pas d expertise d nécessaire. n Pas d éd équipement nécessaire. n Sang total Détection possible même en cas de séquestration s des parasites ( (P. falciparum). PRIX (Europe 2005) : Parasight F 4.5 ICT F 4 Ultimed 2.8 Paracheck 1.5 HRP-2 (2) Pas de quantification. Sensibilité Détecte uniquement P. falciparum. Persistance des antigènes nes après traitement (entre 3 et 35 jours). [68 à 7 jours, 27 % à 28 jours] Faux négatifs n avec hautes parasitémies possibles (prozone Dilution? ). Faux négatifs n si délétion d ou expression hétérogh rogène du gène g HRP-2, 2, Faux positifs avec facteur rhumatoïde, syndromes inflammatoires, hépatites h virales, Exemple : Now ICT HRP-2 / Aldolase SENSIBILITE : De l ordre l de 95 % (P.f.) 96 % (parasitémie > 5000 P.v./µl) 100 % (parasitémie entre 1000 et 5000 P.v./µl) 71 % (parasitémie entre 500 et 1000 P.v./µl) 70 % (parasitémie entre 100 et 500 P.v./µl) 33 % (parasitémie < 100 P.v./µl) De l ordre l de 60 % (autres espèces) SPECIFICITE : De l ordre l de 89 % (P.f.) De l ordre l de 95 % (autres ) HRP-2 / Aldolase (2) Rapide (< 15 minutes). Pas d expertise d nécessaire. n Pas d éd équipement nécessairen cessaire. Sang total. Détection possible même en cas de séquestration des parasites (P. falciparum). Pseudo différentiation des PRIX (Europe 2005) : ICT Now 5 Pas de quantification. Sensibilité + Faible sensibilité pour P.vivax. (et P. ovale et P. malariae). Coût. Persistance des antigènes nes HRP-2 2 après traitement (entre 3 et 35 jours), idem pour l aldolasel Faux négatifs n avec hautes parasitémies possibles (prozone( prozone). Faux négatifs n si délétion d ou expression hétérogène du gène g HRP-2, 2, Faux positifs avec facteur rhumatoïde, etc. Différentiation limitée e des Infections mixtes peu identifiables. Exemple : Optimal pldh SENSIBILITE : % (P.f.) De l ordre l de 94 % (P.v.) (61 %?) Plus basse pour autres espèces SPECIFICITE : % (P.f.) De l ordre l de 97 % (P.v.) Plus basse pour autres espèces 4

5 Rapide (< 15 minutes). Pas d expertise d nécessaire. n Pas d éd équipement nécessaire. n Sang total. Pseudo différentiation des Détection possible même en cas de séquestration s des parasites (P. falciparum). Persistance courte après traitement (5-10 jours). PRIX (Europe 2005) : Optimal : 2.1 pldh (2) Pas de quantification. Sensibilité + Faible sensibilité pour P. ovale et P. malariae. Infections mixtes non identifiables. Faux négatifs n avec hautes parasitémies possibles (prozone). Faux positifs avec facteur rhumatoïde (moins que pour HRP- 2), etc. mies non actives (gamétocytes de P. falciparum) donnent un test positif. Différentiation limitée e des Exemple : Palutop+4 HRP-2 2 / pldh SENSIBILITE : % (P.f.) De l ordre l de 95 % (P.v.) Plus basse pour autres espèces SPECIFICITE : % (P.f.) De l ordre l de 96 % (P.v.) Plus basse pour autres espèces HRP-2 2 / pldh (2) 2. Détection des parasites (microscopie). Rapide (< 15 minutes). Pas d expertise d nécessaire. n Pas d éd équipement nécessaire. n Sang total. Pseudo différentiation des Infections mixtes (peu) identifiables. Détection possible même en cas de séquestration s des parasites (P. falciparum). Persistance courte après traitement pldh (5-10 jours). PRIX (Europe 2005) : Palutop+4 : 8 Pas de quantification. Sensibilité + Faible sensibilité pour P. ovale et P. malariae. Faux négatifs n avec hautes parasitémies possibles (prozone). Faux positifs avec facteur rhumatoïde Persistance des antigènes nes HRP-2 après s traitement (entre 3 et 35 jours). mies non actives (gamétocytes de P. falciparum) donnent un test positif. Différentiation limitée e des espèces (aucune distinction P.o et P.v.). QBC. Coloration de Giemsa sur GE ou frottis sanguins (ph 8; Giemsa 3,5 %; 20 min.) GE : GE si + FROTTIS FROTTIS GIEMSA (hémolyse et coloration) Éosine (acide) colore les éléments basiques. Bleu de méthylm thylène (basique) colore les éléments acides. Azur (basique) colore les éléments acides. Mise en évidence des parasites. Quantification (parasitémie/ mie/µl l de sang). Pré différentiation des Différentiation des Quantification (% GR parasités). s). Dilution extemporanée e du colorant. Influence du ph. 5

6 GE et Frottis coloré colorés au Giemsa Équipement et ré réactifs simples. Sensible : < parasites/µ parasites/µl (100 CONCLUSIONS parasites/µ parasites/µl?). Diffé Différentiation des espè Quantification. Diffé Différentiation de parasité parasitémies actives (asexué (asexuées)/ non actives (sexué (sexuées). Détermination des infections mixtes. Microscope né nécessaire. > 60 minutes avant un ré résultat. Nécessite une expertise. (Subjectif). Coû Coûteuse en personnel. Nuits et WeekWeek-end? GE et frottis restent le standard d d or. Associé Associé avec une (ou des) recherche(s) d antigè antigènes parasitaires.! Un test rapide né négatif ne confirme rien! PRIX : Golden standard 0,12 0,40 $ + dé détection et identification UTILISATION SUR LE TERRAIN : GE ou test rapide? possible des microfilaires, de la trypanosomiase et des fiè fièvres récurrentes. P. falciparum P. vivax (caracté (caractéristiques en frottis sanguin) Hématies parasité parasitées normales. Normalement pas de schizontes dans le sang pé périphé riphérique, excepté excepté en cas d'infection grave. (caracté (caractéristiques en frottis sanguin) Hématies parasité parasitées agrandies et dé déformé formées. Tous les stades évolutifs sont possibles. Trophozoï Trophozoïtes fins, en forme de Forme amiboï amiboïde typique Gamé Gamétocytes en forme de bananes; bagues; formes accolé accolées; image uniforme, polyparasitisme. polyparasitisme. une dizaine de jours aprè après l'invasion initiale des hé hématies. Taches de Maurer possible (ph=8). Fortes parasité parasitémies possibles pouvant atteindre plus de 5 %. P. ovale P. malariae (caracté (caractéristiques en frottis sanguin) Hématies parasité parasitées variables en volume; déformé formées. Tous les stades évolutifs sont possibles. Parasites moyennement compacts. Schizontes mû mûrs à 8 noyaux en moyenne, n'occupant pas toute l'hé l'hématie. Granulations de Schü Schüffner évidentes. mie n'excé n'excédant pas 0,5 %. pour les trophozoï âgé âgés. Schizontes mû mûrs à 16 noyaux ou plus. Granulations de Schü Schüffner fines, mais absentes chez les formes jeunes. mie n'excé n'excédant pas 1%. (caracté (caractéristiques en frottis sanguin) Hématies parasité parasitées normales ou réduites. Tous les stades évolutifs sont possibles. Forme en bande typique pour les trophozoï (rare). Schizontes mû mûrs à 6-12 noyaux, situé situées à la pé périphé riphérie du parasite avec pigment rassemblé rassemblé au centre. Les parasites sont petits, compacts, foncé foncés Pigment pré précoce. mie n'excé n'excédant jamais 0,5 %. 6

7 GE né négative GE positive, P. falciparum trophozoï ++++ Frottis sanguin né négatif Frottis sanguin positif, P. falciparum trophozoï GE positive, P. falciparum trophozoï + GE positive, P. vivax trophozoï Frottis sanguin positif, P. falciparum gamé gamétocyte Frottis sanguin positif, P. vivax, 1 gamé gamétocyte et 2 trophozoï QUANTIFICATION EN GE Négative si aucun parasite n n est retrouvé retrouvé GE positive, P. ovale trophozoï Frottis sanguin positif, P. ovale trophozoï trophozoïte dans 100 champs microscopiques (objectif 50 x ou 100 x) Comptage des formes asexué asexuées rencontré rencontrées par +/+/- 200 leucocytes (gamé (gamétocytes compté comptés sé séparé parément) Nombre de parasites asexués comptés x Numération leucocytaire = Nombre de Parasites/µl de sang Nombre de leucocytes comptés GE positive, P. malariae schizontes Frottis sanguin positif, P. malariae trophozoï trophozoïte en bande QUANTIFICATION EN GE 1-9 parasites asexué asexués / 100 champs = parasites asexué asexués / 10 champs = parasites asexué champs = +++ asexués / 1 >10 parasites asexué asexués / 1 champs = ++++ QUANTIFICATION EN FROTTIS Comptage du nombre de globules rouges parasité parasités par des formes asexué asexuées du parasite sur au moins 25 champs microscopiques à l objectif 100 x (50 x). Dé Détermination pré rythrocytes préliminaire du nombre moyen d é d érythrocytes pré présents par champs microscopique 100 x (ou 50 x) Nombre d érythrocytes infectés x 100 = % d hématies parasitées Nombre d érythrocytes observés 7

8 Sur le terrain : GE : Coû Coût - (salaires locaux) Quantification Diffé Différentiation espè espèces mies actives / inactives Peu de chance de rater les parasité parasitémies +++ (sauf séquestration [rare]) : Expertise +++ moins décentralisable Nuits et soiré soirées? Supervision +++ QC+++ Tests rapides : Expertise + plus facilement décentralisable 24h/24h Supervision + QC +++ : Coû Coûts + (importation $) Certaines espè espèces peu diagnostiqué diagnostiquées Persistance de la positivité après tt. positivité aprè mies +++ donnent des FN Sensibilité Sensibilité faible pour parasité parasitémie basse (zone non endé endémiques) Variations de qualité qualité dans les lots Anomalies biologiques évocatrices d une malaria Thrombopé Thrombopénie, Ané Anémie, Bilirubine élevé levée surtout indirecte, LDH élevé levées, Haptoglobine basse. 8