Docteur Laurent PELLETIER

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1 Biologie Cellulaire Chapitre 2 : Méthodes d études en biologie cellulaire Docteur Laurent PELLETIER MED@TICE PCEM1 - Année 2006/2007 Faculté de Médecine de Grenoble - Tous droits réservés.

2 Méthodes d études Cellule animale : µm Microscopie photonique 0,2 μm à 1 mm 1838 : Doctrine cellulaire de Schleiden et Schwann Microscopie électronique 1940 : 1-22 nm Fixation, colorations

3 Méthodes d étude Histologie Fixation Inclusion / Congélation (ultra-)microtome Coloration

4 DNA : Méthodes d étude 1944 O.T. Avery 1953 J.D. Watson & F.H.C. Crick Genetic code : M. Nirenberg & H.G. Khorana DNA cloning : 1972 P. Berg Hybridization : 1975 E.M. Southern Fast Sequencing : 1977 W. Gilbert & F. Sanger PCR : 1983 K. Mullis Historique Transgenesis : 1993 S. Spielberg Human genome sequenced : 2001

5 Méthodes d étude Génomes séquencés Organisme taille approx. (nbre gènes) H.influenzae C.jejuni Y.pestis E.coli S.cerevisiae C.elegans H.sapiens autres (souris, plasmodium, etc...)

6 Méthodes d étude Adipocyte Même génomeg Neurone Expression différente

7 Méthodes d étude Genome gènesg Transcriptome Proteome protéines Statique, connu Dynamique, dépendant du context, inconnu Dynamique, dépendant du context, inconnu

8 Etude des gènes Méthodes d étude Southern blot : ADN northern blot : ARN PCR : Polymerase Chain Reaction Puce d ADN Enzymes de restriction Clonage Séquençage

9 Méthodes d étude Les techniques de ciblage moléculaire Immuno-histochimie Immuno-fluorescence Hybridation In Situ

10 Méthodes d étude Les techniques de ciblage moléculaire Immuno-histochimie CD31

11 Méthodes d étude Les techniques de ciblage moléculaire Immuno-histochimie Colon - tissu normal Fort immuno-marquage nucléaire PCNA des cellules épithéliales (glandes). Marquage modéré dans les cellules musculaires.

12 Méthodes d étude Les techniques de ciblage moléculaire Immuno-fluorescence ICAM-2 2 (FITC) Actine α-sm (Cy5) Immunohistochemistry markers to distinguish between vascular smooth muscle and endothelial cells. A cryosection of mouse heart ventricle was simultaneously stained with FITC-conjugated smooth muscle α-actin antibody (A) and an antibody against the apical endothelial membrane protein, ICAM-2 (B). The secondary antibodies to detect ICAM-2 was Cy-5 conjugated donkey anti-rat (pseudo-colored red for clarity). Panel C is an overlay of the preceding two panels.

13 Méthodes d étude Les techniques de ciblage moléculaire Hybridation in situ (HIS) Section de cerveau de souris : Les points noirs indiquent l expression d un gène dans des régions spécifiques A cross-section through the

14 Méthodes d étude Immuno-histochimie, Immunofluorescence, FACS, Hybridation In Situ, Southern-blot, western blot, northern-blot même combat! Enzyme, fluorochrome Secondaire Sonde Cible

15 Southern blot Coloration BEt

16 Southern blot Transfert par capillarité puis par courant électrique.

17 Southern blot

18 Les puces d ADN Objectif : Comparer les cdna (gènes exprimés) de cellules normales et cancéreuses

19 Les puces d ADN Cellules normales Cellules cancéreuses GCAT GACT GACT TCAG CGTA CTGA ATGC AGTC Membrane + sondes

20 Les puces d ADN vert = normal rouge = cancer Rouge&vert = normal & cancer noir = pas d expression

21 Les puces d ADN

22 Les puces d ADN Principe généralg Analyse informatisée e du signal d'hybridation (Station de travail ) Obtention d'un profil d'expression de gènesg gène A gène B gène C gène D gène E gène F corrélation avec les données cliniques

23 FACS Cytométrie trie en flux (FACS FACS : Fluorescence Activated Cell Sorter)

24 FACS 4 N 4 N 2-44 N 2 N 2 N 4 N

25 FACS DNA Analysis Nombre de cellules Pic d aneuploïdie (DNA index 1.21) N 4 N Intensité de Fluorescence

26 FACS PMT 4 Flow cell Dichroic Filters PMT 1 Bandpass Filters PMT 2 Laser PMT 3 Purdue University Cytometry Laboratories, modified by R.F. Murphy

27 ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) Dosage d un anticorps Dosage d un antigène

28 ELISA

29 ELISA Enzymes Phosphatase alcaline Peroxydase (HRP) Substrats PNPP incolore (4-nitrophényl-phosphate) OPD + H 2 O 2 (orthophénylène diamine) Luminol + H 2 O 2 Produits Jaune Orange Luminescent ELISA anticorps anti-hiv GP120

30 Western blot Séparation & transfert des protéines + détection d protéine d intd intérêt = WB Electrophorèse en gel d acrylamided ou PAGE-SDS (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis Sodium Dodecyl Sulfate) Coloration des protéines au bleu de Coomassie

31 Western blot Préparation et séparation s des protéines

32 Western blot Electro-transfert transfert sur nylon ou nitrocellulose

33 Western blot

34 Electrophorèse 2D SDS-PAGE (PM) IEF (pi)

35 Spectrométrie de masse N-Laser TOF-MS Detector Quantité relative Analyse d un d échantillon tumoral Masse (Da)

36 Spectrométrie de masse Tumeur A-1 Tumeur A-2 Tumeur A-3 Tumeur NA-1 Tumeur NA-2 Tumeur NA-3

37 Spectrométrie de masse Tumeur A-1 Tumeur A-2 Tumeur A-3 Tumeur NA-1 Tumeur NA-2 Tumeur NA-3 Echantillons Pics protéiques Tumeur A-1 Tumeur A-2 Tumeur A-3 Tumeur NA-1 Tumeur NA-2 Tumeur NA-3

38 Culture cellulaire Culture cellulaire 1907 : doctrine neuronale Explants tissulaires Cellules isolées Dissociation mécanique, enzymatique, EDTA Sélection EDTA : Acide éthylène diamine tétracétique

39 Sélection Marquage direct Culture cellulaire Marquage indirect

40 Culture primaire Culture cellulaire Culture secondaire Cellule unique (clonage) Culture secondaire Culture primaire : Population polymorphe de cellules Culture secondaire

41 Culture cellulaire Cellules Observation Hela Contraste Microscopie de phase à contraste de phase Vidéo-microscopie Contraste interférentiel

42 Culture cellulaire Observation Immunofluorescence Labelling of mitochondria, F-actin network, and nuclear DNA

43 Culture cellulaire Conditions de culture 37 C, ph, sels, CO 2 Milieu de culture Milieu de base +/-Sérum Facteurs de croissance Support

44 Culture cellulaire Immortalisation Les cellules non tumorales ont un nombre de divisions limité Croissance cellulaire

45 Culture cellulaire Immortalisation Introduction d un oncogène (SV 40, Myc) qui immortalise la cellule sans la rendre tumorale Cellules tumorales exple : He(nrietta) La(cks)

46 Culture cellulaire Cellule normale Cellule immortalisée Cellule transformée Divisions Ancrage, Fact. Croiss., Inhib. Contact. Cellules normales cellules cancéreuses

47 Culture cellulaire Intérêts Fondamental Diagnostique Thérapeutique

48 Culture cellulaire Mélanocytes tumoraux en culture

49 Culture de cellules de moelle osseuse humaine Culture cellulaire Ulex Europeaus Agglutinin-1 (UEA-1) Facteur de Von Willebrand (vwf) Collagène IV

50 Culture cellulaire Microscopie Electronique à Transmission (MET)

51 Culture cellulaire C B Actine α SM A vwf

52 Techniques d étude des fonctions cellulaires A Aspirating canula B Ultrasonic dissociation Dissociated tissues "human auto-culture medium" C D E

53 Méthodes d étude in vivo Greffes de cellules cellules souches cellules tumorales Transfert de gènes Souris transgéniques souris mucoviscidose souris prédisposées au cancer Souris Knock-out

54 Méthodes d étude in vivo Modèles de tumorigenèse Contrôle AE-941 Volume tumoral (cm 3 ) 60 Témoin Æ Temps (jours)

55 Méthodes d étude in vivo Transfert de gènes : Modifications expérimentales du patrimoine génétique Transfert de gènes in vitro ou in vivo Vecteurs viraux ou non viraux Une expérience heureuse ou malheureuse à l hôpital Necker?

56 Méthodes d étude in vivo

57 Méthodes d étude in vivo Transfert de gène Promoteur Profil d expression spatial et temporel cdna Gène d intérêt Intron AAAA Transgène <1kb to >200kb AAAA

58 Méthodes d étude in vivo Transfert de gène Promoteur 1- Ubiquitaire 2- Spécifique d un tissu (Cerveau, foie, muscle ) 3- Inductible (tétracycline, interféron...) cdna Gain de fonction - Gène sauvage -mutant Perte de fonction - dominant négatif -antisens

59 Méthodes d étude in vivo Gène rapporteur : Promoteur du gène X Gène X Promoteur du gène X Gène rapporteur - β galactosidase - Luciférase - GFP - autres. Aequorea victoria GFP : Green Fluorescent Protein

60 Méthodes d étude in vivo neurogenin 1

61 Méthodes d étude in vivo FVB/N-TgN(MMTVneu)202Mul Promoter: MMTV, mouse mammary tumor virus Gene : Erbb-2 (HER-2; HER2; Neu; Neu oncogene; c-erbb2; c- neu; neu protooncogene) Souris homozygotes viables et fertiles Pas de phénotype chez les mâles Expression du transgène détectable dans l épithélium mammaire normal, les glandes salivaires et le poumon. Tumeurs focales apparaissent autour de 4 mois

62 Méthodes d étude in vivo

63 Méthodes d étude in vivo Green Fluorescent Protein (GFP) Témoin 9.5 day embryos

64 Méthodes d étude in vivo GFP Témoin Adulte

65 Méthodes d étude in vivo

66 Méthodes d étude in vivo Cellules de moelle osseuse Transfert du gène GFP (rétrovirus) Cellules de moelle osseuse Cellules GFP

67 Méthodes d étude in vivo Cellules de moelle osseuse GFP Coupes de cervelet 4 semaines 15 semaines Souris irradiée léthalement? Cellules sanguines

68 Méthodes d étude in vivo Hémisphère témoin A Hémisphère lésé B 1 j Après lésion C D 14 j Après lésion

69 En bio cell : Problème A Il y a des QCM et des QCMproblèmes à l examen B Il y a toujours au moins 1 réponse exacte (1 à 5) C Chaque QCM vaut 1 à 3 point(s) D J ai 1 ; 0.5 ; 0.2 ; 0 point(s) si je fais 0 ; 1 ; 2 ; 3 erreur(s), respectivement E Y a plus qu à

70 Problème Concernant cette population cellulaire Cel0 : A - Le sérum permet la survie B - Le sérum permet la prolifération C - L EGF est indispensable à la survie D - Le plateau de croissance atteint à 96h de culture indique que les cellules ont conservé leur inhibition de contact E - Ces caractéristiques sont compatibles avec la croissance de cellules transformées EGF : Epermal Growth Factor

71 Problème A propos de cette expérience : A - L iodure de Propidium est un agent fluorescent qui se lie à l ADN et permet ainsi d en estimer la quantité B - Le premier pic (gauche) correspond aux cellules en phase G1 C - Le second pic (droite) correspond aux cellules en phase S D - Les cellules Cel2 prolifèrent plus que les cellules Cel1 E - La population Cel2 est aneuploïde

72 Problème Les cellules Cel5 et Cel6 sont transfectées avec un plasmide comprenant : - Le promoteur du gène EGF-R devant le gène codant la GFP et avec un second plasmide comprenant le gène codant la - BFP (protéine fluorescente bleue) sous le contrôle du promoteur du gène fos. Des cellules normales de même origine subissent les mêmes modifications. Inducteur X Pro-EGFR Pro-EGFR EGFR Inducteur Y Pro-Fos Pro-Fos Fos GFP BFP

73 Problème Pro-EGFR GFP Pro-EGFR EGFR Pro-Fos Fos Expression Induction Pro-Fos BFP Si activé EGF-R

74 Problème Auantité (unités arbitraires) GFP Cellules témoins Cel5 Cel6 BFP = EGF-R = Fos A propos de cette expérience : On mesure les quantités des deux protéines fluorescentes produites par les deux populations cellulaires. A - Les gènes GFP et BFP sont des gènes rapporteurs B - L expression de la GFP reflète celle du récepteur à l EGF C - L expression de la protéine BFP, comme celle de fos, est sous le contrôle de l activation de la voie de signalisation de EGF-R D - Le récepteur de l EGF est sur-exprimé dans les cellules Cel5 E - La voie de signalisation en aval de EGF-R est sur-activée dans les cellules Cel5 et Cel6

75 Exemple de thérapie génique Alain Fischer, Hôpital Necker, Paris Déficit Immunitaire Combiné Sévère lié à l X (DICS-X) Moelle osseuse : cellules précurseurs γc : sous-unité des R des IL-2, 4, 7, 9, 15 γc absente ou inopérante

76 Exemple de thérapie génique Alain Fischer, Hôpital Necker, Paris Déficit Immunitaire Combiné Sévère lié à l X (DICS-X) 10 patients de 1-9 mois Aspiration médullaire Selection des progéniteurs CD34+ Exposition à des vecteurs rétroviraux contenant le cdna de la chaîne γc Greffe des cellules

77 Exemple de thérapie génique Alain Fischer, Hôpital Necker, Paris Suivi précoce : T, NK Reconstitution normale du pool Réponses vaccinales normales 3 mois : Retour à la maison

78 Exemple de thérapie génique Alain Fischer, Hôpital Necker, Paris Science 17 th October 2003 Octobre 2002 : 2 patients développent une leucémie Vecteur rétroviral intégré dans ou à proximité de LMO2 Surexpression de LMO2

79 Exemple de thérapie génique Alain Fischer, Hôpital Necker, Paris Intégration aléatoire Des rétrovirus NON!!! Insertion dans la chromatine ouverte transcriptionnellement active

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