Aurélia Chambaz 47 ème volée ESSanté Stage d immuno-hématologie à l UMT, BH-18 CHUV SRTS VD Lausanne Responsable accompagnante :

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1 Aurélia Chambaz 47 ème volée ESSanté Stage d immuno-hématologie à l UMT, BH-18 CHUV SRTS VD Lausanne Responsable accompagnante : Mme Jocelyne Conne

2 Résumé Ce travail en immuno-hématologie a pour but d observer les similitudes et les discordances entre les Coombs directs (CD 1 ) réalisés en tubes et les autocontrôles (EP 3 ) effectués en carte en Coombs indirect (CI 2 ). Ces deux tests sont des techniques de référence à l UMT 4. En effet, il est connu que si un Coombs direct est positif, le Coombs indirect n est pas interprétable, car il sera forcément lui aussi positif étant donné que les globules rouges sont sensibilisés. Or au mois de septembre 2007, un Coombs direct a été trouvé positif avec un anti-jka fixé découvert après élution, alors que l autocontrôle avait été effectué et était négatif. Il n y avait également pas d anticorps circulants dans le plasma de la patiente. Il est donc facile de voir l importance de vérifier la concordance des résultats entre ces deux tests, afin de savoir si les procédures du laboratoire sont efficaces ou si des hématies sensibilisées ne sont fréquemment pas détectées en ne réalisant que l autocontrôle? Cette analyse a été effectuée sur 200 patients qui avaient un Coombs direct positif selon les analyses effectuées dans l un ou l autre des deux laboratoires de l UMT, ceci sur une durée de 7 semaines. Les résultats obtenus ont montré qu une divergence entre les résultats du Coombs direct et de l autocontrôle existait dans près de 25% des cas analysés. L autocontrôle a donc l air d être moins sensible que le Coombs direct, ceci principalement en ce qui concerne la molécule du C3d 6 ou lorsque la spécificité est de type IgG 5 avec un titre relativement bas. La technique en cartes semble également être moins sensible pour les bébés, mais ceci n est pas une affirmation étant donné le nombre restreint de bébés analysés au cours de ce travail. En vue de tout cela, on pourrait donc conclure qu il n est pas possible de se fier uniquement à l autocontrôle pour affirmer l absence d hématies sensibilisées chez un patient. Les abréviations ou mots se trouvant en italique avec un numéro en exposant dans le texte sont décrits dans le lexique p

3 Resume This work on immunohaematology aim to observe the similarities and the discordances between the direct Coombs realised in tubes and the auto controls of indirect Coombs effected on cards. These two tests are the technics of reference in the UMT. Actually, it is known that if a direct Coombs is positive, this direct Coombs is not interpretable, because it will be certainly positive also as that the red globules are sensiblized. Therefore, in September 2007, a direct Coombs was found positive with a fixed anti-jka discovered after elutions, however, the auto control had been done and was negative. There are equally no antibodies which circulate in the plasma of the patient. So it is easy to see the importance to check the concordance the results between the two tests, to know if the procedure of lab is efficient or if the sensible haematins are not frequently detected in only realizing the auto control? This analyse is effected on 200 patients who has a positive direct Coombs according to the analyses effected in one or another of 2 labs of UMT, which had been done during 7 weeks. The result obtained showed that the divergence between the result of direct Coombs and the auto control existed in about 25% of the analysed cases. The auto control seems to be less sensible than the direct Coombs, this presents principally in the molecule of C3d 6 or when the specificity is of type IgG 5 with a relatively low title. The technic on cards seems equally to be less sensible for the babies, but this isn t an affirmation for the reason that the restrict number of babies analysed in the current of this work. For all of this, we could conclude that it isn t possible to confide only in the auto control to affirm the absence of sensibilized haematins of a patient

4 Table des matières 1 Introduction Contexte de ce travail Présentation du cas : Résumé des analyses effectuées pour ce travail Rappel théorique pour la compréhension de ce travail Antigènes : Anticorps : Complément : Test de Coombs : But du travail Démarche et estimation des coûts pour ce travail Techniques Techniques en tubes : Coombs directs polyspécifique et monospécifique Medion : Coombs direct polyspécifique DiaMed : Titre d un Coombs direct IgG : Elution : Techniques en cartes : Dépistage et identification d anticorps : (Cartes LISS/Coombs) Autocontrôle en Coombs indirect (EP) : (Cartes LISS/Coombs + Cartes Coombs Anti-IgG) Coombs direct : (Cartes LISS/Coombs + Cartes Coombs Anti-IgG) Spécificités d un Coombs direct : (Cartes DC-Screening I) Titre d un Coombs direct IgG : (Cartes TDA IgG-Dilution) Sous-classes d IgG : (Cartes TDA IgG 1 /IgG 3 ) Matériel et consommables Matériel fixe et appareils Consommables Matériel : Réactifs et leur composition : Gestion des lots de réactifs : Résultats Explicatif pour les tableaux de résultats se trouvant à l annexe Tableaux des résultats Analyse des résultats Conclusion Difficultés rencontrées Perspectives Remerciements Bibliographie Lexique Annexes

5 1 Introduction J effectue mon dernier stage de la formation de technicienne en analyses biomédicales (TAB 7 ) à l unité de médecine transfusionnelle au CHUV 8 à Lausanne. Ce laboratoire appartient au SRTS VD 9 et réalise différentes analyses dans le domaine de l immuno-hématologie, ainsi que la gestion et la distribution des différents produits sanguins labiles. S agissant de mon dernier stage, je dois réaliser mon travail de diplôme au cours de celui-ci. Le sujet m a donc été proposé par Mme Jocelyne Conne, avec l accord du Professeur Jean- Daniel Tissot, et va vous être présenté ci-après. 1.1 Contexte de ce travail L idée de ce travail de diplôme est survenue suite à la découverte fortuite d un anti-jka fixé sur les globules rouges d un patient (Coombs direct positif IgG avec un anti-jka fixé après recherche sur l éluat) alors que la recherche d anticorps circulants dans son plasma, ainsi que l autocontrôle réalisé avec ses érythrocytes et son plasma, étaient négatifs. Cette découverte a belle et bien eu lieu par hasard, car dans les procédures du laboratoire de l UMT, si une recherche d anticorps circulants est réalisée avec un EP, le CD ne doit pas être effectué. A moins bien sûr que l EP soit positif, ce qui n était pas le cas dans cette situation. Je cite, selon la procédure de laboratoire intitulée Choix des tests prétransfusionnels (mai 2007), «En cas de résultat négatif de l autocontrôle (fait lors de l identification des anticorps), il n est pas nécessaire d effectuer un test direct à l antiglobuline humaine.» (point 2.1.3, p.2) Les résultats de l EP et du CD devant en principe concorder, voilà l importance d investiguer là-dessus avec ce travail de diplôme. Cela permettra de vérifier si des hématies sensibilisées (et plus particulièrement avec des alloanticorps) ne sont fréquemment pas détectées en suivant les directives de cette procédure ou si ce cas reste exceptionnel Présentation du cas : N de tube : N de malade : Patiente de 1941 Découverte du EP Plasma en Liss/Coombs carte Pap/Coombs (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) / Eluat en Liss/Coombs - (+) - - (+) (+) - (+) - - (+) / carte Pap/Coombs (+) / Plasma en N hématies-test / tube Liss/Coombs / Tableau réalisé selon le classeur des résultats d identification du laboratoire de septembre 2007 RAS Papaïne 10 (connu) Eluat : Anti-Jka AGH 11 (nouveau) CD : IgG 1/8, EP Nég!!! IgG 1 12 nég, IgG 3 12 nég Phénotype Cc/Ee, K nég, k +, Kpa nég, Kpb + Phénotype Jka et Jkb pas déterminé à l UMT car il y avait une double population dans le gel Echantillon envoyé à Berne pour phénotypage : Jka nég, Jkb +, Fya nég, Fyb

6 1.2 Résumé des analyses effectuées pour ce travail Au cours de ce travail, les analyses suivantes vont être réalisées : Pour le travail de diplôme proprement dit, l autocontrôle (plasma + globules rouges du patient) va être effectué en carte en Coombs indirect pour tous les Coombs directs positifs en tubes, afin de vérifier si les résultats sont identiques ou si des discordances se présentent. Les deux techniques sus-mentionnées font partie des techniques de référence du laboratoire. En parallèle, la direction du centre a profité de l occasion pour me demander d effectuer d autres analyses concernant les Coombs, mais les résultats obtenus suite à ces analyses ne doivent pas être analysés dans ce travail de diplôme. Il s agit de comparer deux sortes de Coombs polyspécifique pour la méthode en tube, deux sortes de carte Coombs pour la technique en gel, de comparer la technique de Coombs direct en tube et en gel, les spécificités en tube et en gel, et enfin les dilutions de l IgG en tube et en gel. Les différents réactifs utilisés et comparés seront décrits plus loin dans le travail au point : Réactifs et leur composition. 1.3 Rappel théorique pour la compréhension de ce travail Antigènes : Selon Queloz, Siegenthaler, Conne, Schneider & Tissot (juillet 2005), «[un antigène est une] substance capable de provoquer une réponse immune, puis de réagir spécifiquement avec le produit de cette réponse (anticorps ou lymphocytes). [ ] [Les antigènes de groupes sanguins sont soit] des protéines seules, soit des protéines associées à des lipides, soit des protéines glycosylées, ou soit des hydrates de carbone». (p.15) Un antigène possède des déterminants antigéniques ou épitopes à sa surface. Chacun d entre eux est capable de réagir avec un anticorps unique et spécifique. (Queloz, Siegenthaler, Conne, Schneider & Tissot, juillet 2005, p.15) Anticorps : Les anticorps sont des immunoglobulines présentes dans le plasma. Ils sont synthétisés par les lymphocytes B (ou cellules dérivées) et sont le produit d une réponse immune. «Au cours de cette réponse immunitaire, les anticorps ont trois fonctions principales : - se lier à l'antigène - activer le système du complément - recruter des cellules immunocompétentes» (Selon la page web intitulée Anticorps). Schéma d une immunoglobuline de type IgG :

7 La partie constante des chaînes lourdes détermine selon sa nature, 5 isotypes ou classes d anticorps (γ IgG, α IgA 13, μ IgM 14, δ IgD 15, ε IgE 16 ). Il existe également pour chaque classe des sous-classes. La partie constante des chaînes légères détermine quant à elle 2 types d anticorps (κ ou λ). Chaque classe d anticorps peut donc être de l un ou l autre de ces types. (Queloz, Siegenthaler, Conne, Schneider & Tissot, juillet 2005, p.18) Complément : Selon la page web intitulée Système du complément : Le système du complément est une cascade biochimique complexe du système immunitaire, entraînant une cytolyse 17, une chimiotaxie 18, une opsonisation 19 et une inflammation 20. Le système du complément consiste en plus de 35 protéines membranaires ou circulantes dans le plasma. Parmi elles, 12 sont directement impliquées dans les voies métaboliques du complément, alors que le reste a des fonctions régulatrices. [Pour son activation, le complément a besoin de la présence de Ca ++ et de Mg ++. Les principales protéines du complément sont notées de C1 à C9, elles migrent en électrophorèse dans la fraction des β-globulines et ont un poids moléculaire de 100 à 200 kda 21 ]. [ ] Il y a trois voies biochimiques qui activent le système du complément : - la voie classique du complément - la voie alternative du complément - la voie des lectines liant les mannanes [ ] Les différentes voies activant le complément aboutissent à la formation d'une C3 convertase, point de départ de la voie effectrice commune qui détruit la cible en formant un canal transmembranaire, permettant l'entrée de molécules d'eau, [de protéines, d ions] dans la cellule. La voie classique est spécifique car elle est activée par les complexes antigène-anticorps, les deux autres voies sont activées par la reconnaissance innée des organismes étrangers. (Queloz, Siegenthaler, Conne, Schneider & Tissot, juillet 2005, p.21). L activation du complément après fixation des anticorps sur la membrane érythrocytaire dépend : - de la quantité d anticorps - de la classe ou sous-classe de l anticorps (IgM>IgG3>IgG1) - des propriétés des anticorps. Les anticorps capables d activer le complément sont appelés hémolysines. Si l activation atteint C9, il y a une lyse intravasculaire des globules rouges, si elle atteint C3b, les globules rouges sont détruits par les macrophages du foie et finalement, si les hématies sont simplement sensibilisées par des IgG, les globules rouges sont détruits par les macrophages de la rate. (Queloz, Siegenthaler, Conne, Schneider & Tissot, juillet 2005, p.22-23) Test de Coombs : Le test de Coombs, que l on appelle aussi test à l antiglobuline, porte le nom d un scientifique anglais, Sir Robin R. Coombs. Le sérum de Coombs, grâce à l antiglobuline qu il contient, permet de mettre en évidence la présence d anticorps anti-érythrocytaire à la surface de globules rouges

8 Ces anticorps sont reconnus spécifiquement selon l antiglobuline présente dans le sérum de Coombs utilisé (anti-igg, anti-igm, anti-iga). Il existe également des sérums de Coombs dirigés contre des fractions du complément (anti-c3d, anti-c3b, ). Les sérums de Coombs polyspécifiques sont composés d un mélange de différentes spécificités ou d une immunoglobuline qui reconnaît les chaînes légères κ et λ des anticorps. Il faut au minimum 200 molécules d IgG sur un globule rouge pour que la réaction puisse être positive Test de Coombs direct ou TDA 1 : Ce test révèle par une agglutination la présence d hématies sensibilisées 22 in vivo par des anticorps incomplets 23. Les hématies sont donc directement mises en contact avec le sérum de Coombs. Ce test permet par exemple de diagnostiquer une anémie hémolytique auto-immune, de faire le bilan d une incompatibilité foeto-maternelle ou d une réaction transfusionnelle. Schéma du principe : Test de Coombs indirect (CI) ou TIA 2 : Ce test révèle quant à lui la présence d un complexe antigène/anticorps, ceci dans différents cas de figure : - soit lors de la recherche d anticorps irréguliers 24 incomplets circulants dans le plasma d un patient, grâce à des hématies connues (hématies-test). - soit lors de la détermination d un phénotype de groupe sanguin, grâce à des anticorps connus (sérums-test). - soit lors de la réalisation du test de compatibilité où le plasma du receveur est mis en contact avec les globules rouges du donneur. On l appelle indirect, car dans un premier temps, il faut fixer l anticorps recherché sur les hématies connues ou vice et versa (fixer un anticorps connu sur les hématies dont on veut déterminer un phénotype de groupe sanguin). Ou encore fixer un anticorps inconnu sur des hématies inconnues (test de compatibilité). Cette première étape se nomme sensibilisation et s effectue à 37 C

9 Puis ensuite, dans un deuxième temps, le sérum de Coombs peut être ajouté afin d obtenir ou non une agglutination. Il ne faut encore pas oublier de préciser qu un test de Coombs indirect ne peut être interprété que si le test de Coombs direct du patient est négatif, ceci dans le cas où l on utilise ses globules rouges pour le test de Coombs indirect. En effet, si le CD est positif, les globules rouges sont déjà sensibilisés et le CI sera forcément positif. Schéma du principe : (la légende est la même que pour le schéma du principe du CD) anticorps connu (sérum-test) On peut remarquer sur les 2 schémas, qu une étape de lavage (3x) des hématies sensibilisées est nécessaire, aussi bien pour le CD que pour le CI. Ces lavages permettent de se débarrasser du plasma entourant les globules rouges, et donc ainsi aussi des différentes protéines libres présentent dans ce dernier et qui pourraient neutraliser le réactif de Coombs (anticorps non-fixés). Ceci élimine une bonne partie de faux négatifs. Ces lavages ne sont toutefois pas toujours nécessaires pour les techniques en cartes grâce à la filtration des globules rouges à travers le gel. A l UMT, les tests de Coombs directs et indirects trouvés négatifs doivent systématiquement être vérifiés au microscope, puis du Coombs contrôle doit y être ajouter (cf. point ). Les tests de Coombs directs positifs de spécificité IgG doivent être élués, et selon les cas, l élution peut également être faite s il s agit d autres spécificités. L élution consiste à détruire les globules rouges afin de détacher les anticorps qui y sont fixés, ceci afin de pouvoir les identifier à l aide d un panel d hématies-test. (Selon Queloz, Siegenthaler, Conne, Schneider & Tissot, juillet 2005, p et pages web intitulées Test de Coombs et Antiglobuline)

10 2 But du travail Le but de ce travail de diplôme et d observer les similitudes et les différences entre les Coombs directs et les autocontrôles en Coombs indirect. En effet, malgré les différences de techniques et de réactifs, chaque patient avec un Coombs direct positif, devrait avoir son autocontrôle en Coombs indirect également positif étant donné que ses globules rouges sont sensibilisés. Or, suite à la découverte d une discordance, il est facile de voir l importance de vérifier cela au cours de ce travail de diplôme. Peut-on se fier ou non à l autocontrôle pour affirmer l absence d hématies sensibilisées chez un patient? 3 Démarche et estimation des coûts pour ce travail Pour réaliser ce travail, l objectif était de prendre en compte tous les Coombs directs trouvés positifs au cours des analyses journalières, ceci aussi bien au laboratoire des urgences d immuno-hématologie (604) qu au laboratoire de routine (511) et de les analyser selon la démarche suivante. 1) Pour chaque CD positif en tubes avec le réactif polyspécifique DiaMed, le refaire avec celui de Medion et vice et versa. 2) Pour chaque CD positif en tubes, un CD ainsi qu un autocontrôle en Coombs indirect (EP) seront effectués en gels. (cartes-id LISS/Coombs) 3) Les mêmes tests seront effectués mais sur une autre sorte de cartes. (cartes-id Coombs Anti-IgG) 4) Pour chaque CD positif en tubes, les spécificités seront également effectuées en gels. (cartes-id DC-Screening I) 5) Pour chaque CD positif de spécificité IgG en tubes, la dilution sera aussi faite en gels. (cartes-id TDA IgG-Dilution) 65% des CD positifs sont de spécificité IgG, d après le rapport annuel. 6) 1 élution avec dépistage en LISS/Coombs et en Coombs Anti-IgG a été comptabilisée par jour, ce qui revient à environ 60 élutions sur la durée fixée pour les analyses. (cartes-id LISS/Coombs) et (cartes-id Coombs Anti-IgG) 7) Pour les dépistages positifs d éluats, une identification sera faite, les sous-classes IgG 1 et IgG 3 seront également effectuées. (cartes-id TDA IgG1/IgG3) Les cartes du labo seront utilisées car ces cas sont rares. Pour réaliser ceci, le projet était d analyser 7 Coombs directs trouvés positifs / 24h, sur une durée de 2 mois, d où un total de 400 CD positifs traités sur la durée définie. Ci-dessous, un tableau des coûts pour la commande des cartes est présenté. En effet, la direction du centre m a demandé de m intéresser uniquement aux cartes pour l estimation des coûts liés à ce travail. (Il s agit de la part la plus importante, qui nécessite un budget «extraordinaire», malgré une généreuse participation de la firme DiaMed)

11 Prix : Etape Nombre de cartes Prix unitaire (CHF) Prix total (CHF) cartes-id LISS/Coombs cartes-id Coombs Anti-IgG cartes-id DC-Screening I cartes-id TDA IgG-Dilution cartes-id LISS/Coombs + 60 cartes-id Coombs Anti-IgG Total 1060 cartes Techniques Voici en quelques mots, les différentes techniques nécessaires pour la réalisation de ce travail de diplôme. (Ces techniques sont décrites plus en détail dans les procédures du laboratoire qui se trouvent en annexes A, pages 28 à 35) 4.1 Techniques en tubes : Coombs directs polyspécifique et monospécifique Medion : 2 gouttes de sérum de Coombs + 1 goutte d hématies à tester lavées 3x et mise en suspension 3-5% dans de l Immusol (couleur framboise). Centrifuger 15 secondes à 2500 tours par minute, puis lire l agglutination sur une lampe. Vérifier au microscope tout Coombs qui semble être négatif. Si la négativité est confirmée, ajouter 1 goutte de Coombs control (seulement pour les sérums polyspécifiques et le monospécifique anti-igg), centrifuger de la même manière et lire l agglutination qui doit être positive. Dans le cas contraire, recommencer la procédure, sinon protocoler les résultats Coombs direct polyspécifique DiaMed : Il s agit de la même procédure que la précédente, sauf qu il faut mettre 1 goutte de sérum de Coombs Titre d un Coombs direct IgG : Préparer les dilutions géométriques du sérum de Coombs monospécifique anti-igg dans de l Immusol. Ensuite la procédure est la même qu au point 4.1.1, pour chaque dilution jusqu à que le Coombs devienne négatif (maximum jusqu à 1/2048). La dernière dilution où une agglutination est observée donne le titre du Coombs Elution : Laver 3x les hématies à analyser (1ml), ensuite ajouter 1ml d Immusol, puis 2ml de chloroforme. Incuber 5 minutes à 56 C en remuant constamment avec une touille en bois. Centrifuger 5 min à vitesse rapide (3500 tours par minute) et récupérer le surnageant (éluat) dans un nouveau tube. Effectuer ensuite le dépistage ou/et l identification d anticorps sur l éluat

12 4.2 Techniques en cartes : Dépistage et identification d anticorps : (Cartes LISS/Coombs) 50 μl de chaque hématie-test dans le puits correspondant + 25 μl de plasma (ou éluat) à analyser dans chaque puits. Incuber les cartes 15 minutes à 37 C, puis les centrifuger 10 minutes à 910 tours par minutes. Lire les résultats et les protocoler. Pour l identification faire un puits supplémentaire avec un autocontrôle (cf. point 4.2.2) Autocontrôle en Coombs indirect (EP) : (Cartes LISS/Coombs + Cartes Coombs Anti-IgG) 10 μl d hématies à analyser dans 1 ml de LISS (diluent 2 de DiaMed). Déposer ensuite 50 μl de cette suspension dans un puits et ajouter 25 μl du plasma du même patient. Incuber 15 minutes à 37 C, puis centrifuger 10 minutes à 910 tours par minutes. Lire les résultats et les protocoler Coombs direct : (Cartes LISS/Coombs + Cartes Coombs Anti-IgG) 10 μl d hématies à analyser dans 1 ml de LISS (diluent 2 de DiaMed). Déposer ensuite 50 μl de cette suspension dans un puits et centrifuger 10 minutes à 910 tours par minutes. Lire les résultats et les protocoler Spécificités d un Coombs direct : (Cartes DC-Screening I) Il s agit de la même procédure qu au point 4.2.3, sauf qu il faut utiliser les 6 puits de la carte Titre d un Coombs direct IgG : (Cartes TDA IgG-Dilution) Il s agit de la même procédure qu au point 4.2.4, sauf qu il faut laver 3x les hématies à analyser avant de les utiliser Sous-classes d IgG : (Cartes TDA IgG 1 /IgG 3 ) Laver 3x les hématies à tester, ensuite mélanger 10 μl de ces hématies dans 1 ml de LISS (diluent 2 de DiaMed). Déposer 50 μl de cette suspension dans chaque puits de la carte et centrifuger 10 minutes à 910 tours par minutes. Lire les résultats et les protocoler. 5 Matériel et consommables 5.1 Matériel fixe et appareils -Pipettes automatiques -Pipette dispenser -Portoirs pour tubes et cartes -Chronomètre -Centrifugeuses (tubes en verre, tubes patients et cartes) -Incubateur à 37 C -Bains-marie 56 C -Laveuse de globules rouges -Microscope -Lampe de lecture

13 5.2 Consommables Matériel : -Tubes en verre standards et à élutions -Petits tubes en plastique (mélanges avec la solution de LISS) -Pipettes en plastique -Touilles pour élutions -Embouts pour pipettes et dispenser Réactifs et leur composition : Sérum de Coombs polyspécifique DiaMed pour méthode en tube : Ce sérum contient une antiglobuline de lapin de type IgG. Cette IgG n est pas dirigée spécifiquement contre les chaînes lourdes des IgG humaines, mais réagit également avec les chaînes légères des anticorps, d où une possible activité supplémentaire anti-igm et anti-iga. Il ne contient pas d anti-complément, ce dernier n est en effet pas indispensable, car les anticorps qui ne peuvent être détectés que par leur aptitude à se lier au complément sont rares. De plus, cela permet d éviter l interférence liée au composant complément fixé non-spécifiquement aux hématies Sérum de Coombs polyspécifique Medion pour méthode en tube : Ce sérum contient des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre les IgG humaines, ainsi que des anticorps monoclonaux murins avec une activité anti-c3b et anti-c3d. Ces anticorps se trouvent dans une solution de chlorure de sodium tamponnée contenant de l albumine bovine et 0,1% d azide de sodium (NaN 3 ) comme conservateur Sérums de Coombs monospécifiques (anti-igg, anti-igm, anti-iga, anti-c3d) Medion pour méthode en tube : Ils contiennent des anticorps polyclonaux de lapin dirigés spécifiquement et respectivement contre les IgG, les IgM, les IgA humaines, ainsi que contre la molécule C3d du complément Coombs contrôle Medion pour méthode en tube : Ce réactif contient des hématies de groupe sanguin O Rhésus pos sensibilisées avec un anti-d incomplet (IgG) humain en solution isotonique tamponnée et contenant des agents conservateurs (suspension d hématies à 5±1%). Il sert à vérifier le bon fonctionnement des sérums de Coombs qui ont une activité anti- IgG et l efficacité des lavages, ceci lorsque l on a un résultat négatif. En effet, il se produit une agglutination lorsque l on ajoute le contrôle si l activité du sérum de Coombs est intacte et si les lavages ont été réalisés correctement. Ceci permet d éviter des faux-négatifs

14 Immusol Compact de Medion pour méthode en tube : Concentré (20x) pour la préparation de 10 litres de solution saline isotonique tamponnée à ph 7,3±0,2. A diluer dans de l eau déminéralisée. Il contient également 0,4% d azide de sodium. Cette solution sert à la mise en suspension des hématies, à la réalisation des lavages, ainsi qu à la dilution des plasmas et sérums Chloroforme de Merck KGaA pour les élutions : Il s agit de CHCl 3 p.a. (pour analyse), avec une pureté de 99,0-99,4% et une masse molaire de 119,38g/mol Cartes-ID LISS/Coombs de DiaMed pour méthode en gel : Les 6 puits de cette carte contiennent un gel avec des billes de dextran, ainsi que du sérum de Coombs polyspécifique avec des anticorps polyclonaux de lapins dirigés contre les IgG humaines, ainsi que des anticorps monoclonaux de la lignée cellulaire C avec une activité anti-c3d Cartes-ID Coombs Anti-IgG de DiaMed pour méthode en gel : Les 6 puits de cette carte contiennent quant à eux du sérum de Coombs avec des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre les chaînes lourdes des IgG humaines, mais ces anticorps réagissent également avec les chaînes légères des anticorps, d où une activité supplémentaire anti-igm et anti-iga Cartes-ID DC-Screening I de DiaMed pour méthode en gel : 1 puits de la cartes contient du sérum de Coombs monospécifique avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-igg humaines ; le puits suivant contient du sérum de Coombs monospécifique avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-igm humaines ; le suivant contient du sérum de Coombs monospécifique avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-iga humaines ; le puits suivant contient du sérum de Coombs monospécifique avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-c3c ; ensuite il y a un puits avec du sérum de Coombs monospécifique avec des anticorps monoclonaux de la lignée cellulaire C anti-c3d. Le dernier puits est un contrôle négatif Cartes-ID TDA IgG-Dilution de DiaMed pour méthode en gel : 5 des 6 puits de cette carte contiennent du sérum de Coombs monospécifique avec des anticorps polyclonaux de lapin dirigés spécifiquement contre les IgG humaines à des dilutions respectives de 1:10, 1:30, 1:100, 1:300 et 1:1000. Le dernier puits est un contrôle négatif

15 Cartes-ID TDA IgG 1 /IgG 3 de DiaMed pour méthode en gel : Les 2 premiers puits de la carte contiennent un anti-igg 1 monoclonal de la lignée cellulaire M345/795 en 2 dilutions différentes (1:1 et 1:100) ; les 2 puits suivant contiennent un anti-igg 3 monoclonal de la lignée cellulaire M346/805 en 2 dilutions différentes (1:1 et 1:100) ; le 5 ème puits contient un anti-igg polyclonal de lapin à une dilution de 1:10. Le dernier puits est un contrôle négatif Hématies-tests DiaMed (RAI + ID) pour méthode en gel : ID-DiaScreen est composé d hématies-tests provenant de donneurs individuels de groupe sanguin O et phénotypées pour les antigènes les plus importants en immuno-hématologie. Il s agit de 6 suspensions tamponnées d hématies à 0,8±0,1% en flacon de 10 millilitres pour le dépistage d anticorps irréguliers. Les hématies-tests V et VI sont papaïnées. Les conservateurs sont les antibiotiques triméthoprime et sulfaméthoxazole. ID-DiaPanel et ID-DiaPanel P (papaïné) se composent d hématiestests provenant de donneurs individuels de groupe sanguin O et phénotypées pour les antigènes les plus importants en immunohématologie. Il s agit de 11 suspensions tamponnées d hématies à 0,8±0,1% en flacon de 4 millilitres pour l identification d anticorps irréguliers. Les conservateurs sont les antibiotiques triméthoprime et sulfaméthoxazole Solution de LISS modifié de DiaMed (ID-Diluent 2) pour méthode en gel : Echantillons de sang : Il s agit d une solution tamponnée de NaCl à ph 6,7, de faible force ionique qui augmente le taux d association des anticorps sur les antigènes et permet donc de réduire le temps d incubation. Cette solution a été modifiée par adjonction d albumine bovine 5%, de glycine et de gélatine. Il sert pour la préparation des suspensions d hématies. Il contient les antibiotiques triméthoprime et sulfaméthoxazole comme conservateurs. Les échantillons de sang qui ont été utilisés tout au long de ce travail proviennent de patients dont les analyses de laboratoire révélaient un test de Coombs direct positif. Il s agit de prélèvements effectués sur anticoagulant EDTA. Les analyses nécessaires à ce travail ont été réalisées sur des tubes qui avaient entre 0 et 4 jours (mais décantés et mis au frigo le jour du prélèvement)

16 (Les différents explicatifs des réactifs proviennent de leur mode d emploi, les photos des réactifs DiaMed sont tirées du site de la firme et les photos des autres réactifs ont été faites au laboratoire) Gestion des lots de réactifs : Les réactifs employés pour la réalisation de ce travail de diplôme avaient le numéro de lot suivant : (se référer aux tableaux des résultats pour les numéros de cas) Sérum de Coombs polyspécifique DiaMed : Lot : Expiration : Labo 511 : A partir du cas n 61 Lot : Expiration : Labo 604 : A partir du cas n 90 Lot : Expiration : Sérum de Coombs polyspécifique Medion : Lot : A Expiration : Labo 511 : A partir du cas n 163 Lot : A Expiration : Sérums de Coombs monospécifiques Medion : Anti-IgG : Labo 511 : Lot : A Expiration : Labo 604 : Lot : A Expiration : A partir du cas n 91 Lot : A Expiration : Anti-IgM : Lot : A Expiration : Anti-IgA : Lot : A Expiration : Anti-C3d : Lot : A Expiration : Labo 511 : A partir du cas n 74 Lot : A Expiration : Labo 604 : A partir du cas n 97 Lot : A Expiration : Coombs contrôle Medion : Labo 511 : Lot : Expiration : A partir du cas n 15 Lot : Expiration : A partir du cas n 105 Lot : Expiration : Labo 604 : Lot : Expiration : A partir du cas n 106 Lot : Expiration : Immusol Compact Medion : Chloroforme (Article ) Merck: Lot : Expiration : Lot : K Expiration : A partir du cas n 98 Lot : K Expiration :

17 Cartes-ID LISS/Coombs DiaMed : Cartes pour mon travail : Lot : Expiration : Cartes du labo : Lot : Expiration : Labo 511 : A partir du cas n 102 Lot : Expiration : Labo 604 : A partir du cas n 106 Lot : Expiration : Cartes-ID Coombs Anti-IgG DiaMed : Cartes pour mon travail : Lot : Expiration : Cartes-ID DC-Screening I DiaMed : Cartes pour mon travail : Lot : Expiration : A partir du cas n 115 Lot : Expiration : Cartes-ID TDA IgG-Dilution DiaMed : Cartes pour mon travail : Lot : Expiration : Cartes-ID TDA IgG 1 /IgG 3 DiaMed : Cartes du labo : Lot : Expiration : Labo 511 : A partir du cas n 200 Lot : Expiration : Hématies-tests DiaMed ID-DiaScreen : Lot : Expiration : A partir du cas n 97 Lot : Expiration : Hématies-tests DiaMed ID-DiaPanel : Lot : Expiration : A partir du cas n 97 Lot : Expiration : Hématies-tests DiaMed ID-DiaPanel P : Lot : Expiration : A partir du cas n 97 Lot : Expiration : Solution de LISS modifié DiaMed (ID-Diluent 2) : Lot : Expiration : Labo 604 : A partir du cas n 53 Lot : Expiration : Labo 511 : A partir du cas n 102 Lot : Expiration :

18 6 Résultats 6.1 Explicatif pour les tableaux de résultats se trouvant à l annexe B La date qui figure en premier correspond au jour où j ai effectué les analyses, le jour entre parenthèses est celui du prélèvement. Dans la colonne année de naissance, F = Femme et H = Homme. Lorsqu un numéro entre parenthèses suit le F ou le H, cela veut dire que le patient à déjà été analysé ultérieurement, ceci au numéro correspondant. Pour les colonnes des techniques en tubes, Tout ce qui est écrit uniquement en noir correspond aux analyses que j ai effectué moi-même car elles n avaient pas eu besoin d être faites par les techniciennes du laboratoire. Lorsque un résultat est écrit en noir, mais suivi d un résultat entre parenthèses en rouge, cela veut dire que j ai refait l analyse car elle n avait pas été réalisée le jour même, mais 1-2 ou 3 jours plutôt. Le résultat en rouge correspond donc à celui obtenu par les TAB le(s) jour(s) précédents. Lorsque le résultat est uniquement écrit en rouge, cela veut dire que les analyses ont été effectuées le jour même, je n ai donc pas eu besoin de les refaire, le résultat est celui trouvé par l une des TAB du laboratoire. Dans les colonnes titre IgG et suivantes, NF = Non Fait. Dans la colonne ID plasma, RAI Nég = dépistage d anticorps négatif ID Nég = identification d anticorps négatif RAS = Réaction Aspécifique ACA = Anticorps Chauds Aspécifiques AFA = Anticorps Froids Aspécifiques Pap = milieu enzymatique (Papaïne) AGH = milieu à l antiglobuline humaine (Coombs) α = Anti p.d. = plus décelable look = à l image de = jusqu à Dans la colonne ID éluat, Les résultats entre parenthèses n ont pas été faits mais, il s agit de résultats connus suite à une élution ultérieure. Les résultats en rouge sont ceux où j ai effectué en plus une élution suite aux résultats que j ai obtenus avec les méthodes testées. (Apparition d une IgG avec les méthodes en cartes)

19 6.2 Tableaux des résultats Ci-dessous les résultats nécessaires à l analyse de ce travail et qui permettront d atteindre le but recherché. Au total, 200 cas ont été analysés Les résultats complets se trouvent dans l annexe B pages 36 à 45. Cas CD EP Elution Cas CD EP Elution NF NF NF NF NF Nég NF Nég NF NF 26 + BB Nég NF NF Nég Nég Nég NF NF Nég NF NF NF NF NF Nég Nég NF 35 + BB NF NF Nég 37 + BB Nég Nég NF Nég NF NF Cas CD EP Elution Cas CD EP Elution NF Nég NF NF NF Nég NF Nég Nég NF NF NF NF Nég NF NF NF NF Nég Nég NF Nég NF Nég Nég 73 + BB Nég NF NF NF NF Nég Nég NF Nég NF Nég NF Nég

20 Cas CD EP Elution Cas CD EP Elution Nég NF Nég NF NF NF NF Nég NF Nég NF Nég NF Nég NF NF Nég Nég NF NF NF NF NF NF NF Nég Nég Nég Nég Nég NF Nég NF NF Nég Cas CD EP Elution Cas CD EP Elution NF NF NF NF NF Nég NF NF Nég NF Nég Nég BB Nég Nég NF NF NF NF NF BB Nég NF NF NF NF Nég NF BB NF NF Nég NF Nég Nég Nég BB Nég Nég NF Nég