L EPISSAGE. I- Introduction

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1 L EPISSAGE I- Introduction Lors de la transcription des gènes codant les protéines par l ARN polymérase II, il y a synthèse d un ARN prémessager qui contient l ensemble nucléotidique du gène comprise entre le site d initiation de la transcription (+) et le site de la polya. L ARN prémessager doit subir une maturation en 3 étapes successives : formation de la coiffe, épissage des exons et polyadénylation. 1) Historique Comment a évolué l épissage au cours de l évolution? - Chez la levure le gène équivaut { peu près { celui de l ARNm correspondant. - Chez l Homme les messagers sont beaucoup plus petits, cela est dû à la taille des introns et à leur nombre. Au cours de l évolution c est la taille et le nombre qui évolue. Le nombre d introns par gène et leur taille sont différents. Notre génome contient 4000 Méga-base. En moyenne, nous avons 7 exons/gène. Pendant des années, on s est dit que les introns ne servaient { rien, mais ils contiennent beaucoup d informations. La taille des introns est de 1-5kb pouvant aller à 50kb. 2) Techniques pour localiser les introns On peut mettre en évidence les introns par Southern, en dégradant l ADN via enzyme de restriction, qu on séparé alors par électrophorèse et qu on fait migrer avant de faire une hybridation avec de l ADNc ne contenant pas de site de l enzyme utilisée. L autoradiographie nous révèle alors les introns. On peut également, pour déterminer le nombre d exons, utiliser la technique de la nucléase S1. Cette enzyme peut digérer l ADN qui n est pas en double brin. On l utilise sur un hybride ARNm/ADN pour couper les parties «seules» de l ADN, qui correspondent donc aux introns. Par analyse sur gel, on peut ensuite retrouver ces brins. Enfin, on peut utiliser la technique de la PCR en parallèle sur de l ADNg et de l ADNc avec les mêmes amorces pour amplifier des fragments de tailles différentes. L épissage est un phénomène dont l importance augmente avec la complexité du génome, puisque le nombre, et la longueur des introns, augmentent avec la complexité du génome. Biologie Moléculaire Mme Presse Page 1

2 II- Mécanismes d épissage Chaque étape va permettre d éliminer les introns. L importance de l épissage augmente avec la complexité du génome. 1) La réaction d épissage L épissage se fait en 2 étapes de transestérification : Lors de la première étape, il y a une ouverture de la jonction exon/intron au niveau de la borne 5 par attaque nucléophile du 2 OH de l adénosine interne qui va former une liaison covalente. Cette liaison va former une boucle de type «lasso» au niveau de l intron. Lors de cette étape, il y a attaque du site 3 par le 3 OH libre de l exon en 5. Les 2 exons sont associés (épissés) et l intron libéré est dégradé. 2) Le spliceosome L épissage se fait grâce à un spliceosome, large complexe composé de : - 5 particules snrnp (small ribonucleoprotein) qui contiennent des snrna (small nuclear RNA bases) et des protéines protéines additionnelles - Les snrnps impliqués dans l épissage sont: U1, U2, U4,U5 et U6 - Chaque snrnp contient 1 seul ARN et environ 20 protéines (7 protéinessm reconnues par un même anticorps et des protéines spécifiques) Tous ces petits ARN ont une structure en trèfle, dont une partie va reconnaitre des séquences bien particulières sur l ARN qui doit être épissée. Biologie Moléculaire Mme Presse Page 2

3 L ARN est balisé par U1 et U2. 1. snrnp U1 reconnait site donneur d épissage, { la borne 5 de l intron grâce { la protéine activatrice déj{ présente sur le site 2. snrnp U2 reconnaît la région 3 de l intron, c{d { la fois d adénine interne, le bloc pyrimidique et la borne 3 3. snrnp U4/U5/U6 associées entre elles vont permettre le rapprochement des particules snrnp U1 et U2 et donc des bornes d introns. Epissages majoritaires : - Le 5 de l intron est très souvent GT - Le 3 de l intron est AG - Le site de branchement est situé à nucléotides III- Epissage alternatif Le génome humain comporte 32 millions paires de bases gènes qui codent pour 100 à protéines Comment est-ce possible de donner naissance à autant de protéines? 1) Définition Epissage alternatif : - concept de l épissage alternatif: années démonstrations scientifiques: années analyses { grande échelle avec le séquençage du génome humain et comparaison des séquences d EST: années % du génome humain subit de l épissage alternatif - fonction biologique: o diversité du protéome o modulation de l activité d une protéine o altération de la stabilité de l ARNm - procédé selon lequel il y a formation, { partir d un ARNm précurseur, de plusieurs combinaisons d exons par un mécanisme d épissage. - dépend du tissu, du stade de développement, de différents stimuli, de l état physiologique. - les protéines formées peuvent avoir des fonctions différentes et parfois inverses Biologie Moléculaire Mme Presse Page 3

4 2) Les différents types d épissage - Promoteurs alternatifs : un promoteur { côté de l exon 1 et un promoteur { côté de l exon 2 - L exonisation = c est un intron qui est devenu un exon dans un autre tissu/arn 3) Son importance Donc l épissage alternatif créer une diversité génétique remarquable. C est un évènement fréquent dans les cellules de mammifères. Les gènes codant pour de 10 à 100 formes ne sont pas rares. Sur le chromosome 22, 60% des gènes codent pour au moins 2 ARNm. - il peut être tissu spécifique - il peut être régulé par des facteurs affectant la transcription - il peut être inductible, exemple par: o la dépolarisation neuronale (déphosphorylation de CaM kinase dans le cas du récepteur NCAM) o un choc thermique (déphosphorylation d une protéine SR) o l activation des cellules T (liaison d une hnrnpl dans le cas de CD45) 4) La régulation La régulation de l épissage alternatif impose des signaux qui modulent l épissage: -enhancers exoniques (ESE) ou introniques (ISE) d épissage: se lient généralement { des protéines SR. -silencers exoniques (ESS) ou introniques (ISS) d épissage: se lient { des protéines hnrnp Biologie Moléculaire Mme Presse Page 4

5 L épissage alternatif peut être également responsable de pathologies, par mutation, activation, ou création de sites d épissages. L épissage alternatif sur le virus du VIH : - Les SR vont conduire { activer l épissage en provoquant la liaison protéine/site de donneur ou site accepteur - Protéines hnrp se lient sur les silencers inhibition C est le rapport des quantités de SR et hnrp qui va moduler l épissage Exemple de maladie : - Β-thalassémie : modification d un nucléotide protéines se collent à un site critique un peu en amont Biologie Moléculaire Mme Presse Page 5