L Eprouvette - Laboratoire public de l Université de Lausanne. De la mutation génétique à la maladie

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1 L Eprouvette - Laboratoire public de l Université de Lausanne De la mutation génétique à la maladie

2 Le Syndrome de l X-fragile? Une maladie héréditaire : qui touche l ADN 1. Qu est ce que l ADN? 2. Que se passe-t il dans l ADN des patients atteints du Syndrome de l Xfragile? 3. Comment le diagnostiquer? 4. Hérédité du syndrome de l X fragile? 5. Les voies pour le traiter 2

3 Ordres de grandeur ADN bases 10 à 200 µm 3 2 nm 2 mètres de long chez l humain!

4 L ADN sous toutes ses formes ADN chromatine Une fois compactées pour former le chromosome, les molécules d ADN sont fois plus courtes! chromosome 4

5 La double hélice d ADN Langue en U Yeux verts Forme du lobe de l oreille Hormone de croissance Protéine nécessaire au bon fonctionnement des neurones 5

6 Les «gènes» 1 gène = 1 portion d ADN Soit 3,4 nm = 0, mm 2 nm = 0, mm 6

7 Un gène promoteur Partie traduite en protéine protéine 7

8 La séquence d ADN Outil des chercheurs 8

9 Cas du Syndrome de l X fragile L étude de familles de patients : anomalie portée par le chromosome X Gène responsable FMR1 (Fragility Mental Retardation 1) défaut de fabrication de la protéine FMRP (Fragility Mental Retardation Protein) FMR1 Impliquée dans le fonctionnement des neurones 9

10 La séquence du gène FMR TCAGTGTTTACACCCGCAGCGGGCCGGGGGTTCGGCCTCAGTCAGGCGCTCAGCTC CGTTTCGGTTTCACTTCCGGTGGAGGGCCGCCTCTGAGCGGGCGGCGGGCCGACGGCG AGCGCGGGCGGCGGCGGTGACGGAGGCGCCGCTGCCAGGGGGCGTGCGGCAGCGCG GCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGG CGGCTGGGCCTCGAGCGCCCGCAGCCCACCTCTCGGGGGCGGGCTCCCGGCGCTA -3 Présente une zone de répétitions de CGG 20 dans la séquence ci-dessus FMR1 C est le nombre de répétitions de CGG qui varie dans le Syndrome de l X fragile Chromosome X 10

11 Les mutations liées au Syndrome de l X-fragile Non muté : n<50 Prémutation 55<n<200 Mutation complète n>200 promoteur hyperméthylé 11

12 L hyperméthylation Cytocine (C) Guanine (G) Groupe méthyl (CH 3 ) Empêchent la traduction du gène et la fabrication de la protéine FMRP 12

13 Le Syndrome de l X-fragile? Une maladie héréditaire : qui touche l ADN 1. Qu est ce que l ADN? 2. Que se passe-t il dans l ADN des patients atteints du Syndrome de l X-fragile? 3. Comment le diagnostiquer? 4. Hérédité du syndrome de l X fragile? 5. Les voies pour le traiter 13

14 Diagnostic génétique du Syndrome de l X fragile Prémutation Compter le nombre de Repérer une hyperméthylation Mutation complète Comment? 14

15 Comment? Recherche d hyperméthylation dans l ADN ADN 1 En coupant les ADN de manière spécifique grâce à des ciseaux moléculaires : Les enzymes de restriction ADN 2 Hyper méthylation La taille des morceaux obtenus nous donnera une estimation des sites de coupures reconnus par les enzymes dans la séquence étudiée 15

16 Les enzymes de restriction 16

17 La «digestion enzymatique» 17

18 Volumes en µl : 1000 µl = 1 ml Protocole ADN 1 ADN 2 Lequel des deux est hyperméthylé? Echantillon Eau ADN Tampon 10X Enzymes Volume final 1 2 PST I XHO I A µl A µl B µl B µl 18

19 Le Syndrome de l X fragile, membre de la famille des «maladies à triplets» liées à des expansions instables de répétitions de 3 bases (ou «trinucléotides») CTG-CTG-CTG-CTG-CTG-CTG CAG-CAG-CAG-CAG-CAG La biologie moléculaire a permis d expliquer les effets d anticipation de ces maladies augmentation du risque de développer la maladie au fur et à mesure des générations 19

20 Les «maladies à triplets» La maladie de Steinert (dystrophie myotonique) gène DMPK Dystrophy Myotonic Protein Kinase nctg myotonine Rôle? Chr 19 Wikipedia 20

21 Les «maladies à triplets» La Chorée de Huntington gène Huntingtin ncag Rôle? Huntingtine de forme différente Chr 4 ncag < < ncag < < ncag < 40 ncag > 40 Non muté Pas de maladie développée, mais transmission possible Grands risques de développer la maladie La maladie surviendra assurément Wikipedia 21

22 Quelques maladies génétiques diagnosticables 22

23 Diagnostic génétique du Syndrome de l X fragile Prémutation Compter le nombre de Repérer une hyperméthylation Mutation complète Comment? Southern blot PCR 23

24 La technique du Southern blot pour le diagnostic du Syndrome de l X fragile 24

25 Southern blot de l X fragile 1 kb = 1000 bases 25

26 Southern blot de l X fragile 1 kb = 1000 bases 26

27 Southern blot de l X fragile 1 kb = 1000 bases Eco RI Eag I Eco RI Eco RI Eag I Eco RI 27

28 Résultats de Southern blot 1 : h sans mutation, non-méthylé 2 : f sans mutation, X inactivé 3 : h avec mutation, méthylé 4 : f avec prémutation, méthylée 5 : f avec mutation, méthylée 28

29 Xp : chr X paternel Xm : chr X maternel Rappel : Inactivation d un X Œuf ou zygote 1ères divisions cellulaires Inactivation au hasard d un des chromosomes X dans chaque cellule : ses gènes ne sont plus exprimés L inactivation est transmise à toutes les cellules descendantes de chaque cellule Le tissu obtenu est une mosaïque : - certaines cellules expriment les gènes du chr Xp - d autres cellules, les gènes du chr Xm 29

30 Analyse de résultats de Southern Blot pour X Fragile Non muté Hyperméthylé Prémutation Mutation complète Homme Femme oui non 1 X X X 2 X X 3 X X X 4 X X X 5 X X X 30

31 Technique de Polymerase Chain Reaction - PCR CGG x 50 CGG x 180 CGG x 300 FMR1 La longueur du morceau amplifié indique le nombre de répétitions de CGG Chromosome X 31

32 Syndrome de l X fragile, analyse par PCR Famille 1 Famille 2 Nombre de CGG 1 - h avec prémutation, 115 CGG 2 - h sans mutation, 29 CGG 3 - h sans mutation, 30 CGG 4 - f (mère) avec pré-mutation, 30 et 95 CGG 5 - f (fœtus) avec mutation complète, 31 et > 200 CGG 6 - h (père) sans mutation, 31 CGG 7 - h (père) sans mutation, 30 CGG 8 - f (fœtus) sans mutation, 27 et 30 CGG 9 - f (mère) avec pré-mutation, 27 et 145 CGG 10 - h sans mutation, 33 CGG 11 - h avec mutation complète, > 200 CGG 12 - contrôle négatif sans ADN 13 - marqueur de taille Monica J. Basehore1 et al.,

33 Diagnostic génétique du Syndrome de l X fragile Southern Blot PCR couper l ADN avec deux enzymes de restriction - Détecter l hyperméthylation - Estimer le nombre de répétitions CGG : mutations complètes photocopier une partie du gène en milliers d exemplaires - Déterminer précisément le nombre de répétitions CGG : prémutations 33

34 Comment? Recherche d hyperméthylation dans l ADN ADN 1 En coupant les ADN de manière spécifique grâce à des ciseaux moléculaires : Les enzymes de restriction ADN 2 Hyper méthylation La taille des morceaux obtenus nous donnera une estimation des sites de coupures reconnus par les enzymes dans la séquence étudiée 34

35 Dépôt dans le gel 35

36 Protocole Préparation des échantillons pour l électrophorèse et le dépôt sur gel d agarose : METTRE DES GANTS!! Attention au BET contenu dans le gel, CANCERIGENE!!! Centrifuger rapidement les échantillons. Mettre 5 µl de bleu de dépôt dans chaque échantillon, bien mélanger. 36

37 Protocole Attendre que l animatrice montre comment déposer avec le marqueur de poids moléculaire. Bien mélanger et reprendre les 25 µl d échantillon. Les déposer doucement dans les puits du gel d agarose. Faire migrer les échantillons à 100V. 37

38 Migration dans le gel

39 Résultat après la migration 39

40 Volumes en µl : 1000 µl = 1 ml Protocole ADN 1 ADN 2 Lequel des deux est hyperméthylé? Echantillon Eau ADN Tampon 10X Enzymes Volume final 1 2 PST I XHO I A µl A µl B µl B µl 40

41 Marqueur de taille en paires de bases 41

42 Electrophorèse des ADN 1 et 2 digérés A1 A2 B1 B pb pb pb pb 800 pb 600 pb 42

43 Les chercheurs face aux maladies génétiques Identifier la zone touchée dans l ADN : la recherche a permis de découvrir en 1991 le gène en cause dans le Syndrome de l X fragile : gène FMR1, situé sur le chromosome X Identifier le rôle de la(es) protéine(s) fabriquée(s) par le (es) gène(s) en question : pas encore précisément connu pour X fragile, FMRP impliquée dans le fonctionnement des neurones. Des 10aines d années de recherche! Mise au point d un diagnostic génétique : en routine pour le Syndrome de l X fragile (sensible à 99%) Chercher un traitement : en cours 43

44 Recherche et maladies génétiques C est un processus long! Il implique de nombreux acteurs : patients et associations de patients, médecins, chercheurs, entreprises pharmaceutiques, pouvoirs publics Liens avec d autres maladies peut donner de nouvelles Informations sur un syndrome donné L étude de l ADN des patients et de leur famille est essentiel! 44

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