Stress osmotique et activation des MAP Kinases ERK1/2 chez les hépatocytes de turbot, Scophthalmus maximus

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1 Stress osmotique et activation des MAP Kinases ERK1/2 chez les hépatocytes de turbot, Scophthalmus maximus : implication des voies de signalisation intracellulaire du processus de RVD. Audrey Fouchs Confrontées à des modifications de leur environnement, les cellules doivent être capables de détecter et d'intégrer ces modifications pour produire une réponse adéquate grâce à un vaste réseau de voies de signalisation intracellulaire. Les stimuli extérieurs sont perçus par l'intermédiaire des diverses structures membranaires, puis un signal est initié et se propage vers les structures les plus profondes de la cellule. Cette propagation du signal implique les activations en cascade de nombreuses molécules et toute la machinerie cellulaire est alors mobilisée pour permettre l'émergence d'une réponse appropriée. Parmi les voies de signalisation servant à la communication entre les cellules et leur environnement, les MAPK (Mitogen- Activated Protein Kinases) sont parmi les plus communes et les plus conservées à travers les espèces. Présentes chez toutes les cellules eucaryotes, les voies MAPK sont typiquement constituées d'une cascade de trois kinases : une MAPK Kinase Kinase activant une MAPK Kinase, celle-ci activant à son tour une MAPK. L'activation des MAPK est induite par phosphorylation sur deux résidus thréonine et tyrosine au sein d'un motif Thr-X-Tyr de leur boucle d'activation. Les protéines MAPK ont été rapportées comme jouant des rôles importants, bien souvent via la mise en place de programmes d'expression génique, dans divers processus fondamentaux comme l'embryogénèse, la différenciation, la prolifération ou encore la mort cellulaire. La cascade MAPK impliquant les protéines ERK1/2 est la première voie MAPK à avoir été caractérisée et la mieux connue. Cette cascade ERK1/2 est constituée de la protéine Raf activant les protéines MEK1 et MEK2, celles-ci activant à leur tour les protéines ERK1 et ERK2. Une fois activées, les ERK1/2 vont phosphoryler de nombreux substrats dans tous les compartiments subcellulaires. Dans les cellules au

2 repos, la localisation de ERK1/2 est principalement cytoplasmique. A la suite d'une stimulation, ces protéines se délocalisent éventuellement pour phosphoryler leurs substrats. Cette cascade Ras/Raf/MEK/ERK est activée en réponse à une large gamme de stimuli incluant les facteurs de croissance, le stress oxydant, les cytokines, le choc thermique, les UV ou encore le stress osmotique et permet le déroulement de mécanismes cellulaires très variés (prolifération, différenciation, migration, apoptose). Le stress osmotique compte donc parmi les nombreux stimuli capables d'activer la cascade MAPK impliquant ERK1/2. Parallèlement à ce processus, le stress osmotique est également capable de déclencher d'autres mécanismes, et plus particulièrement des mécanismes de régulation du volume cellulaire. En effet, des chocs hypo- ou hyper-osmotiques entraînent des modifications du volume cellulaire, dans le sens d'une augmentation ou d'une diminution respectivement. La membrane des cellules animales étant très perméable à l'eau, l'existence d'un gradient osmotique entre les compartiments intra- et extracellulaires déclenche des mouvements d'eau à travers la membrane plasmique : si le gradient est tel qu'il engendre une sortie d'eau, la cellule rétrécit ("shrinkage"). Si le gradient est tel qu'il engendre une entrée d'eau, la cellule gonfle ("swelling"). Ces variations du volume représentent un réel danger pour les cellules et pour leur survie, il est donc essentiel qu elles régulent leur volume. La plupart des cellules confrontées à une diminution ou une augmentation de leur volume sont ainsi capables de mettre en place des mécanismes de régulation pour recouvrer leur volume initial : - Lorsque les cellules sont exposées à un choc hyper-osmotique, elles mettent en place un processus de régulation appelé RVI (Regulatory Volume Increase) pour contrer la diminution du volume cellulaire. Ce processus se caractérise par une entrée nette dans la cellule d'ions Na +, Cl - et d'eau osmotiquement liée et permet un retour complet ou quasi-complet au volume initial. - Lorsque les cellules sont exposées à un choc hypo-osmotique, elles mettent alors en place un processus de régulation appelé RVD (Regulatory Volume Decrease) pour

3 contrer l'augmentation du volume cellulaire. Ce processus se caractérise principalement par une perte d'ions K + et Cl - et d'eau osmotiquement liée, permettant un retour complet ou quasi-complet au volume initial. Le stress osmotique induisant à la fois l'activation des protéines MAPK ERK1/2 chez de nombreux types cellulaires et la mise en place de mécanismes de régulation du volume cellulaire, nous avons, dans cette étude, cherché à savoir s'il pouvait exister un lien entre ces deux mécanismes. Le modèle choisi dans ces travaux est l'hépatocyte de turbot (Scophthalmus maximus), chez lequel le processus de RVD a fait l'objet d'une attention particulière dans notre laboratoire. En effet, le turbot est un poisson plat marin capable de tolérer de larges variations de ses paramètres environnementaux incluant la salinité. Cette résistance étonnante pourrait trouver son origine à l'échelle cellulaire et il a alors été entrepris de caractériser les mécanismes mis en place par les cellules de ce poisson pour contrer les effets des variations d'osmolalité. Plus particulièrement, les hépatocytes, localisés au niveau d'un site anatomique irrigué par la double circulation portale et systémique, peuvent particulièrement être exposés à des variations d'osmolalité extracellulaire. De plus, les hépatocytes présentent un métabolisme très actif les exposant à des modifications de leur contenu en osmolytes. Ainsi, dans des travaux précédents, notre équipe a démontré que les hépatocytes de turbot exposés soudainement à une diminution de l'osmolalité extracellulaire sont capables de mettre en place un processus de RVD et par conséquent de réguler leur volume à la suite d'un gonflement osmotique. Pour tenter de mettre en évidence un lien éventuel entre l'activation des MAP Kinases ERK1/2 suite à un stress osmotique et les mécanismes de régulation du volume cellulaire, il fallait tout d abord vérifier que ces protéines pouvaient être détectées chez les hépatocytes de turbot. Après exposition des cellules à une stimulation hypo-osmotique, des analyses en Western Blot en présence d un anticorps primaire dirigé contre la forme phosphorylée de ERK1/2 ont permis de détecter deux bandes à approximativement 44 et 42 kda, les poids moléculaires attendus pour ERK1 et ERK2 respectivement. Les bandes révélées sont bien

4 représentatives d une détection spécifique par l anticorps primaire, la membrane exposée à l anticorps secondaire uniquement restant totalement blanche. Lorsque les cellules sont incubées avec les inhibiteurs spécifiques de l activation des MAPK ERK1/2 PD98059 et U0126, aucun marquage n est observé, indiquant que les protéines détectées en Western Blot correspondent bien aux protéines MAPK ERK1/2 phosphorylées. Les protéines MAPK ERK1/2 pouvant être détectées chez les hépatocytes de turbot, le premier objectif de ce travail a été de mettre en évidence les effets de variations d osmolalité sur l expression de ces protéines chez notre type cellulaire. Les résultats obtenus ont mis en évidence qu une stimulation hyper-osmotique (de 320 à 400 mosm.kg -1 ) des cellules n entraîne aucune activation des protéines ERK1/2. En revanche, un choc hypo-osmotique (de 320 à 240 mosm.kg -1 ) entraîne une activation rapide de ces protéines qui se maintient au moins 50 minutes après le choc. Ces protéines ERK1/2 phosphorylées proviendraient d un pool de protéines préexistantes, aucune évolution de la quantité totale de ces protéines n ayant été observée à court terme. Dans la deuxième partie de cette étude, nous nous sommes posés la question suivante : les MAPK ERK1/2 participent-elles au processus de régulation du volume des hépatocytes de turbot? Pour répondre à cette question, le processus de RVD de notre type cellulaire a été étudié en présence de PD98059, inhibiteur spécifique de l activation de ERK1/2. Aucune modification du gonflement cellulaire n a été observée et le processus de RVD n est pas significativement modifié. L activation des protéines ERK1/2 ne serait donc pas essentielle à la mise en œuvre du processus de régulation du volume cellulaire chez les hépatocytes de turbot. Si l activation des protéines ERK1/2 n apparaît pas essentielle au processus de RVD de notre type cellulaire, ce processus pourrait en revanche participer à la régulation du signal d activation de ces MAPK. Afin de tester cette hypothèse, différents mécanismes impliqués dans le RVD des hépatocytes de turbot ont été explorés dans la troisième partie de ce travail. Les résultats obtenus ont mis en évidence que les protagonistes clés du RVD des hépatocytes de turbot, tels que l ATP, le calcium, certaines protéines kinases comme la phosphatidylinositol-3

5 kinase, la protéine kinase C ou les tyrosine kinases, le cytosquelette et les canaux SAC mécanosensibles sont impliqués dans l activation de ERK1/2. Plus particulièrement, ces voies de signalisation sont capables de moduler le signal ERK1/2. En effet, chez les hépatocytes de turbot, l activation de ERK1/2 se produit en deux temps : une activation à très court terme (de 0 à 5 minutes après le choc hypoosmotique) indépendante de toutes les voies de signalisation testées et une activation à plus long terme (10 minutes après le choc hypo-osmotique) dépendante de ces mêmes voies de signalisation. Ce travail a donc permis de mettre en évidence l activation des protéines MAPK ERK1/2 suite à une diminution de l osmolalité extracellulaire chez les hépatocytes de turbot. Ces protéines sont rapidement phosphorylées et leur activation est maintenue pendant au moins 50 minutes. Malgré leur phosphorylation rapide, les MAPK ERK1/2 ne semblent pas impliquées dans la mise en place du processus de RVD des hépatocytes de turbot à court terme. Ceci n exclu cependant pas une action de ces protéines à plus long terme visant peut-être au rétablissement de l homéostasie cellulaire. Les ERK1/2 activées pourraient alors intervenir dans la régulation transcriptionnelle des gènes précoces immédiats en activant des facteurs de transcription. Des expérimentations supplémentaires sont nécessaires pour confirmer ou non cette hypothèse. Des interactions entre l activation de ERK1/2 et le processus de RVD ont toutefois pu être mises en évidence. Ainsi, la majorité des voies de signalisation connues comme étant impliquées dans le processus de RVD des hépatocytes de turbot se sont révélées capables de moduler l activation de ces MAPK en étant impliquées dans le maintien de leur activation. Si cette étude a donc permis d identifier certains des éléments permettant de prolonger le signal ERK1/2 dans le temps, des expérimentations supplémentaires seront nécessaires pour apporter des informations concernant les éléments permettant l activation initiale de cette cascade MAPK. De plus, la durée de l activation de ERK1/2 déterminant la spécificité du signal transduit, le rôle de l activation en deux temps des protéines MAPK ERK1/2 chez les hépatocytes de turbot devra être étudié.