Professeur Michel SEVE

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1 UE1: Cycle 4 : Biomolécules (1) : Acides aminés et protéines Chapitre 7 Méthodes d analyse et de séparation des peptides et protéines Professeur Michel SEVE Année universitaire 2009/2010 Université Joseph Fourier de Grenoble - Tous droits réservés.

2 Chapitre 7: Méthodes d analyse et de séparation Plan du cours 2/23 Méthodes d analyse et de séparation des peptides et des protéines Plan du cours 1. Ultrafiltration 2. Chromatographies 2.1. Exclusion en gel 2.2. Echange d ion 2.3. Affinité 3. Electrophorèses 4. Analyse protéomique 5. Détermination structurale

3 Chapitre 7: Méthodes d analyse et de séparation 1. Ultrafiltration 3/19 1. Ultrafiltration

4 Chapitre 7: Méthodes d analyse et de séparation 1. Ultrafiltration 4/19 Méthodes d ultrafiltration Centrifugation Sous pression x g

5 Chapitre 7: Méthodes d analyse et de séparation 2. Chromatographies 5/19 2. Les chromatographies 2.1. Chromatographie sur gel 2.2. Chromatographie d échange d ions 2.3. Chromatographie d affinité Chromatogramme Solvant 1 Solvant 2 Colonne de séparation Pompe Détecteur Système D acquisition De données

6 Chapitre 7: Méthodes d analyse et de séparation 2. Chromatographies 6/ Chromatographie d exclusion sur gel Protéine inclus Protéine exclus

7 Chapitre 7: Méthodes d analyse et de séparation 2. Chromatographies 7/19 Les différents supports sur gel Zone de fractionnement P P P P P P P P P A 1.5M A 5M A 150M Séphadex Bio-gel Sépharose Ultrogel Bioglass Bio-Beads (Ces valeurs ne sont pas à apprendre par cœur)

8 Chapitre 7: Méthodes d analyse et de séparation 2. Chromatographies 8/19 Principe de la chromatographie d exclusion sur gel

9 Chapitre 7: Méthodes d analyse et de séparation 2. Chromatographies 9/ Chromatographie d échange d ions Les résines: sépharose, séphacryl celluloses substituées Les groupements: chargés négativement (échange de cation) - sulfoniques - carboxyliques - phosphates - sulfoéthyl chargés positivement (échange d anions) - diéthylaminoéthyl (DEAE) - aminoéthyl - triméthylamine

10 Chapitre 7: Méthodes d analyse et de séparation 2. Chromatographies 10/19 Charge des protéines - Les protéines ont des charges variables en fonction du ph - Chaque protéine en fonction de sa séquence primaire présente une courbe particulière - Chaque protéine a un point isoélectrique défini

11 Chapitre 7: Méthodes d analyse et de séparation 2. Chromatographies 11/19 Désorption sélective des protéines en fonction du ph

12 Chapitre 7: Méthodes d analyse et de séparation 2. Chromatographies 12/ Chromatographie d affinité Compétition Substrat Antigéne Metal Sucre Hormone Enzyme Anticorps Metalloprotéine Lectine Récepteur (Lavage)

13 Chapitre 7: Méthodes d analyse et de séparation 3. Electrophorèses 13/19 3. Electrophorèse SDS page

14 Chapitre 7: Méthodes d analyse et de séparation 3. Electrophorèses 14/19 Electrophorèse non dénaturante: Analyse des protéines plasmatiques Profil électrophorétique classique Des protéines plasmatiques

15 Chapitre 7: Méthodes d analyse et de séparation 3. Electrophorèses 15/19 Electrophorèse 2D 1D IEF ph 3 ph 10 2D SDS-PAGE MW (kda)

16 Chapitre 7: Méthodes d analyse et de séparation 4. Analyse protéomique 16/19 4. Analyse protéomique

17 Chapitre 7: Méthodes d analyse et de séparation 5. Détermination structurale 17/19 5. Etude de la structure cristallisée par diffraction de rayons X

18 Chapitre 7: Méthodes d analyse et de séparation A retenir 18/19 Eléments majeurs à retenir - Savoir définir les principales techniques d analyse des protéines Ultrafiltration, chromatographies, électrophorèses - Comprendre et savoir expliquer les principes physico-chimiques des différentes techniques - Connaitre la définition de méthodes d analyse plus complexe des protéines Protéomique, Analyse structurale

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