Partec: l innovation en marche depuis 40 ans Principes des appareils de Cytométrie en Flux. Pascal Brunou, David Bastien Partec France

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Damien Falardeau
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2 Partec: l innovation en marche depuis 40 ans Principes des appareils de Cytométrie en Flux Pascal Brunou, David Bastien Partec France

3 en Allemagne et partout dans le Monde Société basée à Münster & Görlitz en Allemagne et créée depuis Fabricant de Cytomètres en Flux et Microscopes à fluorescence ultra-compacts Entreprise privée de + de 100 employés, + de 2000 instruments dans le Monde - 40 brevets internationaux - DIN EN ISO 9001:2000, DIN EN ISO 13485:2003, cgmp, CE, GS, TÜV - Produits offerts sous la Directive (IVD) 98/79/EC PARTEC France: 14/16 rue Gallieni St Geneviève des Bois

+ de 2000 instruments dans le Monde - 40 brevets internationaux - DIN EN ISO 9001:2000, DIN EN ISO 13485:2003, cgmp,

4 Analogie entre microscopie et cytométrie de fluorescence Echantillon fixe sur lame au microscope Echantillon liquide focalisé sous l objectif et le trajet optique du cytomètre Cytométrie: = «mesure des cellules»

Echantillon liquide focalisé sous l objectif et le

5 Système fluidique - Focalisation hydrodynamique LASER PMT 1 PMT 2 Cellule de mesure = cœur du système

6 Excitation par un laser des particules injectées Forward Scatter (FSC) Source d excitation lumineuse ultraperformante type laser pour une excitation et analyse des signaux d émission en quelques microsecondes Laser Side Scatter (SSC) + Fluorescence

type laser pour une excitation et analyse des signaux d

7 Sources lumineuses d excitation

8 Signaux d émission diffusés Diffusion aux grands angles, réflexion et réfractions; structure ou granularité des cellules (SSC) Diffusion aux petits angles, diffraction; Taille des cellules (FSC) Diffusion de Fluorescence aux longueurs d onde supérieur à celle d émission (moins énergétique) Diffusion intrinsèque (autofluorescence) et extrinsèque (FL-1 à Fl-n)

Taille des cellules (FSC) Diffusion de Fluorescence aux longueurs d onde supérieur à

9 Détecteur «Forward Scatter» : FSC La lumière diffusée e vers l avant l (FSC) reflète la taille de la particule

10 Détecteur «Side Scatter» : SSC La lumière diffusée à 90 (SSC) reflète la granularité et la structure (rapport nucléocytoplasmique de la cellule )

fluorescence) - Fluorescence induite par les différents fluorochromes est séparée

11 Fluorescence : FL-1 à Fl-n Excitation et relaxation d une d molécule fluorescente par un photon La fluorescence émise : - Fluorescence intrinsèque (Auto fluorescence) - Fluorescence induite par les différents fluorochromes est séparée par des jeux de filtres optiques choisis en fonction des spectres d excitation et d émission.

12 Différentes approches pour le marquage des cellules Sondes intra-cytoplasmiques Anticorps Sondes ADN Marqueurs de surface - organites cellulaires

13 Quantification des signaux émis Histogramme

14 Dénombrement des cellules /particules Intensité de + fluorescence Concentration en cellules/ml

15 Configuration simple ou multi-couleurs Système Mono-paramétrique Système Multi-paramétrique source d excitation simple / sources multiples

682 BP DUG 11 748 LP CyFlow ML (PE-Cy5, PerCP) Configurations complexes 16 Paramètres, 4 Sources d excitation D9 5 5 D6 D5 D8 D7 D4 5 F M 630 BP DM650 575 BP DM610 710 BP CCD

5) (405 forward scatter) Objective Cuvette DMSP 610 DM560 Objective (APC, Cy5) D12 D14 675 BP 700 BP F M DM650 DM710 FA F M FA 560 BP F M DM500 D10 455 BP F M D1 488 BP (488

16 682 BP DUG LP CyFlow ML (PE-Cy5, PerCP) Configurations complexes 16 Paramètres, 4 Sources d excitation D9 5 5 D6 D5 D8 D7 D4 5 F M 630 BP DM BP DM BP CCD camera DM680 D13 DM750 Q A F M DM500 DM560 F M 488 BP 527/30 BP 748 BP 405 BP D3 635 nm laser #2 D2 488 nm laser #1 FA FA (PE-Cy7) (FITC) (PE-TxR) (PE) (PE-Cy5.5) (405 forward scatter) Objective Cuvette DMSP 610 DM560 Objective (APC, Cy5) D12 D BP 700 BP F M DM650 DM710 FA F M FA 560 BP F M DM500 D BP F M D1 488 BP (488 forward scatter) (APC-Cy5.5) (APC-Cy7) D15 D11 (Cascade Orange) DM420 F M BG BP FA FA (488 Side Scatter) 405 nm laser #3 HBO Lamp #2 & 3 (Hoechst, DAPI, Pacific Blue, Indo(+) w/ 405BP)

17 Domaines d applications (1) Médecine Immunologie Comptage de cellules souches Pathologies Culture cellulaire Apoptose Tri cellulaire CD4/ CD4% HIV - Suivi des Patients en analyses de routine IVD

cellulaire Apoptose Tri cellulaire CD4/ CD4% HIV

18 Domaines d applications (2) Agrosciences: Recherche vétérinaire Aquaculture Biologie végétale Sélection variétale Applications Industrielles: Agroalimentaire. Produits cosmetiques Pharmaceutique Industrie du papier

variétale Applications Industrielles: Agroalimentaire.

19 Domaines d applications (3) Microbiologie: Levures Bactéries Levures Virus & particules sub-microniques Recherche Biotechnologies Viabilité Bactéries Detection de Virus

20 Application directe en œnologie Brettanomyces au microscope Dénombrement direct cells/ml Brettanomyces

21 Merci pour votre attention

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