FACULTÉ DES ARTS ET SCIENCES DÉPARTEMENT DE CHIMIE

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1 Sigle du cours: CHM 3102 page 1 de 11 FACULTÉ DES ARTS ET SCIECES DÉPARTEMET DE CHIMIE SIGLE DU CURS: CHM 3102 TITRE DU CURS: Chimie bioanalytique avancée MS DES PRFESSEURS: Karen Waldron, Pierre Thibault DATE DE L EXAME: lundi le 31 octobre 2005 SALLE: G-715 HEURE: 10:30-12:30 ombre de pages: 13 Maximum de 100 points ATTETI: AUCUE DCUMETATI (ÉCRITE U ÉLECTRIQUE) PERMISE Calculatrice programmable interdite Écrivez : M, PRÉM et CDE PERMAET ci-dessous. Répondez à toutes les questions dans les espaces prévus directement sur le questionnaire. L examen doit être remis au surveillant à l heure précise indiquée sur le questionnaire. Aucun examen ne sera accepté après 12h30. Bien définir tous les paramètres utilisés Accompagnez les formules et les calculs d explications simples et courtes. (Ex.: nommer les axes et les variables, inclure les unités, etc.) n tiendra compte dans la correction de la présentation et de la clarté des exposés. Ci-joint: - Annexes 1à 5 - Constantes, formules et données additionnelles - 1 feuille brouillon Question Résultat 1 /35 2 /15 3 /10 4 /15 5 /10 6 /15 Total /100 M DE L ÉTUDIAT: CDE PERMAET:

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9 Sigle du cours: CHM 3102 page 9 de 11 QUESTI 6 (15 points) Dans le but de purifier un facteur de transcription HXB4 de faible abondance dans une lignée de cellules HeLa on a exprimé cette protéine avec un segment de 6 histidine (6xHis) au bout -terminal (Masse moléculaire : Da, pi : 8.0). Le nombre de His 6 -HXB4 exprimé par cette souche cellulaire est de 5000 molécules par cellule. Votre stratégie analytique de purification compte entre autre l utilisation de la chromatographie d affinité et de la chromatographie d échange d ions. Les rendements d extraction de ces deux techniques de séparation sont de 70 % chacune. a) [5 pts] En sachant que le nombre d Avogadro est 6.02 x molécules/mole, quelle est la nombre minimal de cellules que vous devez cultiver de façon a obtenir au moins 1 mg de His 6 -HXB4? 1mg His 6 -HXB4, rendement global de 49%, 2.04 mg exprimé avant séparation mg correspond a 71.8 nanomoles ou 4.32 x molécules x molécules/5000 molécules par cellule correspond a 8.64 x cellules. b) [5 pts] Décrivez le fonctionnement et les étapes de purification de la chromatographie d affinité utilisant un métal (i 2+ ) immobilisé sur une résine d agarose (immobilized metal affinity chromatography, IMAC) avec une chaîne nitriloacetic acid (TA)? Protéine- 6xHis Metal (i 2+ ) Chelate (tetradentate) Liaison du His 6 -HXB4 a la résine a ph 8 Lavage en tampon Tris-phosphate ph 8 Élution par compétition avec imidazole ( mm) ou par diminution de ph ou en utilisant l EDTA c) [5 pts] Les contaminants majeurs présents dans l extrait protéique après la purification IMAC sont principalement les histones H2B (pi : 10.3) et H3 (pi 10.2) ainsi que les protéines de haute mobilité (high mobility group proteins) HMG-2 (pi 7.0) et HMG-4 (pi 7.5). Les courbes de titrage de ces protéines apparaissent plus bas. Indiquez le type de résine (cationique ou anionique), le ph ainsi que l ordre d élution des différentes protéines pour une séparation optimale du His 6 -HXB4? Charge nette + 0 HMG-2 H2B H3 HMG ph His 6 -HXB4 - Meilleure résolution a ph 9 avec une colonne échangeuse d anion ou H2B et H3 ne seront pas lies. rdre d elution: H2B et H3 (volume mort), suivi de HXB4, HMG-4 et finalement HMG-2.

10 Sigle du cours: CHM 3102 page 10 de 11 AEXE 1: Liste des formules 1 I.U. = 1 mol substrat consommé /min (à T et ph spécifiés et sous conditions de saturation du substrat) [ HA] pk = ph + log [ A ] 1 pi = (pk i + pk j ) 2 V K Vmax = m + V [ S] 1 1 = V V V = V max K + V max [S] m max [S] + K m 1 [S] V = V max max VK [S] m [ S] K [ S] = m + V V V max AEXE 2: Tableau des valeurs de pk a et de pi des acides α-aminés Acide α-aminé pk a pk a pk a pi α-ch α-h 3 + groupement latéral Glycine (Gly, G) Alanine (Ala, A) Valine (Val, V) Leucine (Leu, L) Isoleucine (Ile, I) Proline (Pro, P) Sérine (Ser, S) Thréonine (Thr, T) Cystéine (Cys, C) Méthionine (Met, M) Asparagine (Asn, ) Glutamine (Gln, Q) Phénylalanine (Phe, F) Tyrosine (Tyr, Y) Tryptophane (Trp, W) Lysine (Lys, K) Arginine (Arg, R) Histidine (His, H) Aspartate (Asp, D) Glutamate (Glu, E)

11 Sigle du cours: CHM 3102 page 11 de 11 AEXE 3: Valeurs typiques du pk a des résidus trouvés dans les protéines Type de groupement pk a typique Les groupements terminaux -carboxyl amino Les groupements latéraux Acide aspartique (carboxyl) Acide glutamique (carboxyl) Histidine (imidazole) Cystéine (-SH) Tyrosine (phénol) Lysine (-amino) Arginine (guanidinyl) ~12 AEXE 4: Code génétique de l AR messager AEXE 5: Structure des nucléobases H 2 H H 2 H 3 C H H H Adénine (A) H 2 H Guanine (G) H Cytosine (C) H Thymine (T) H Uracile (U)