Influence du nombre de réplicats dans une analyse différentielle de données RNAseq

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1 Influence du nombre de réplicats dans une analyse différentielle de données RNAseq Statisticiens: Sophie Lamarre Steve Van Ginkel Sébastien Déjean - Magali San Cristobal Matthieu Vignes Biologistes: Stéphane Pyronnet Emeline Sarot Agnès Bonnet Remerciements: David Alter, Hatim Hadria et Kais Sahli Réunion du Groupe de travail «Ingénieurs statisticiens de Toulouse» 14 Octobre 2014 Sophie LAMARRE Plateforme GeT-Biopuces à Toulouse sophie.lamarre@insa-toulouse.fr

2 PLAN Introduction sur le séquençage Contexte, traitement et méthodologie d analyse des données Résultats: avec jeu de données réelles faible différentiel avec jeu de données réelles fort différentiel Conclusions Perspectives 2

3 1. INTRODUCTION SUR LE SEQUENCAGE L ADN qui est notre patrimoine génétique, est composé de 4 nucléotides: A, T, C, G. A s associe avec T. C s associe avec G. Séquencer c est lire la suite de nucléotides (A, T, C, G) contenu par l ADN 3

4 1. INTRODUCTION SUR LE SEQUENCAGE Le principe du séquencage2 ème génération 1. Découpage de l ADN en petits morceaux On découpe en X paires de bases (nombre de nucléotides) selon la capacité de la machine à séquencer Note: cette étape s appelle la préparation de la librairie (elle contient d autres étapes qui ne sont pas expliquées ici) 2. Création de copies des fragments d ADN Cette étape s appelle l amplification et permet d avoir plus de matériels pour réaliser le séquençage Ces explications ne visent pas être exhaustives mais les plus simples possibles pour s adapter à des non biologistes 4

5 1. INTRODUCTION SUR LE SEQUENCAGE Le principe du séquencage2 ème génération On met les morceaux d ADN amplifiés sur un support appelé puce, pour les séquencer 3. Séquençage Séquençage par synthèse et libération de proton Technologie Ion-Torrent Sur un puits, on a le même fragment en plusieurs copies. On synthétise (fabrique) le brin complémentaire de chaque fragment, en ajoutant un nucléotide donné. Si le nucléotide matche avec le nucléotide du brin complémentaire alors il y aura libération d un proton et on enregistrera dans un fichier les résultats pour chaque tour (insertion de nucléotides). Même principe sauf que l on colorie le nucléotide inséré en fonction de s il est T, C, A ou G. Séquençage par synthèse et libération de fluorescence - Technologie HiSeq, MiSeq On reconnaît si la base est un A, T, C ou G par différentes techniques selon la technologie de séquençage utilisée (fluorescence, libération de proton ). Différents séquenceurs existent: 454, HiSeq, Miseq, SOLiD, Ion Torrent et ont tous leurs particularités. Ces explications ne visent pas être exhaustives mais les plus simples possibles pour s adapter à des non biologistes 5

6 1. INTRODUCTION SUR LE SEQUENCAGE Le principe du séquencage2 ème génération 4. Reconstitution de la séquence d ADN Cette étape appelée alignement ou mapping, vise à replacer les petits morceaux d ADN appelés reads sur le génome de référence pour reconstituer l enchainement de l ADN. Alignement sur le génome de référence Dans cette explication, on ne parlera pas du cas où le génome de référence n est pas connu. La dernière étape consiste à compter combien on a de reads par gène et faire un tableau de comptage qui est ensuite donné au statisticien (après quelques traitements bio informatiques dont nous ne parlerons pas ici). Ces explications ne visent pas être exhaustives mais les plus simples possibles pour s adapter à des non biologistes 6

7 1. INTRODUCTION SUR LE SEQUENCAGE Evolution très rapide du séquençage 1 ère génération: bas débit (un gène à la fois) Années ème génération: haut débit (tous les gènes d un même organisme en même temps) Années 2005 On parlera uniquement de cette génération dans cette présentation HiSeq 2000 Ion Proton 3 ème génération: va de plus en plus vite, pas besoin d amplification, fragments beaucoup plus grands -> l avenir Années 2014 Encore beaucoup d erreur (15%) 7

8 2. CONTEXTE, TRAITEMENT ET MÉTHODOLOGIE D ANALYSE DES DONNÉES Le séquençage haut débit : technologie récente (apparue vers 2005) Beaucoup de paramètres à optimiser au niveau: -manip traitement des données bio informatique -de l analyse statistique Besoin de savoir combien de réplicats (échantillons biologiques) au minimum il faut avoir pour que l étude réalisée soit fiable 8

9 2. CONTEXTE, TRAITEMENT ET MÉTHODOLOGIE D ANALYSE DES DONNÉES Tableau de comptages: Ce que l on aimerait: La réalité: beaucoup de variabilité -> besoin de réplicats 9

10 2. CONTEXTE, TRAITEMENT ET MÉTHODOLOGIE D ANALYSE DES DONNÉES Traitement des données: Import des données avec le package limma (filtrage des comptages selon les jeux de données) Normalisation (permet d identifier et de corriger les biais techniques de telle sorte que les différences d expression ne soient dues qu à des effets biologiques) avec le package EdgeR Analyse différentielle avec le package EdgeR Packages Bioconductor: edger et limma 10

11 2. CONTEXTE, TRAITEMENT ET MÉTHODOLOGIE D ANALYSE DES DONNÉES Analyse des données: Réalisation de l analyse différentielle avec: Tous les réplicats Tous les réplicats X réplicat(s) (tirage aléatoire avec remise) p value 5% Tableau récapitulatif du nombre de gènes différentiellement exprimés Diagrammes de Venn Stabilité du rééchantillonnage 11

12 Jeu de données issu de l équipe 6 INSERM 1037 (Stéphane Pyronnetet Emeline Sarot) comportant 4 conditions avec chacune 5 réplicats biologiques Organisme: Humain Séquenceur: Illumina Hiseq 2000 Problématique: étude de l action d une protéine impliquée dans la destabilisationdu processus de traduction des ARN cellulaires. Interaction de deux facteurs à deux niveaux La p value corrigée ne permettant pas de détecter des gènes DE dans cette étude, nous avons utilisé la p value brute. Data faible différentiel 12

13 30 tirages aléatoires parmi 4 réplicats 3 réplicats-2 réplicats Informations: -En bleu turquoise: les valeurs extrêmes (+/-200 (seuil arbitraire) gènes DE par rapport au nombre de gènes DE obtenus avec 5 réplicats) Analyse: Avec 4 réplicats, on reste proche des résultats trouvés avec 5 réplicats A A partir de 3 réplicats, les résultats sont instables: c est la loterie Data faible différentiel 13

14 Exemple: essai 5 3 réplicats 2 réplicats 5 réplicats 4 réplicats Analyse: % de gènes communs Entre 5 et 4 réplicats 326 On retrouve beaucoup de gènes DE uniques à chaque analyse ( réplicats) Data faible différentiel 14

15 Mesure de la stabilité du rééchantillonage: On souhaite savoir si les différents essais permettent de sortir approximativement les mêmes gènes DE pour les analyses: - 4 réplicats - 3 réplicats - 2 réplicats Lorsque la p value brute = 5% Procédure: On concatène toutes les listes de gènes pour tous les essais et on garde une liste de gènes uniques, puis on compte dans combien d essais chaque gène est retrouvé. Data faible différentiel 15

16 4 réplicats p value brute = 5% gènes DE sont retrouvés dans 1 essai seulement Analyse: Beaucoup de gènes DE retrouvés uniquement dans un essai Seulement quelques gènes DE retrouvés dans tous les essais réalisés 32 gènes DE sont retrouvés dans les 30 essais effectués Data faible différentiel 16

17 3 réplicats p value brute = 5% gènes DE sont retrouvés dans 1 essai seulement Analyse: Beaucoup de gènes DE retrouvés uniquement dans un essai De moins en moins de gènes DE retrouvés dans tous les essais réalisés par rapport à 4 réplicats 3 gènes DE sont retrouvés dans les 30 essais effectués Data faible différentiel 17

18 2 réplicats p value brute = 5% gènes DE sont retrouvés dans 1 essai seulement Analyse: Beaucoup de gènes DE retrouvés uniquement dans un essai Aucun gène DE n est présent dans plus de 25 essais (sur 30). 1 gène DE est retrouvé dans 25 essais effectués Data faible différentiel 18

19 Conclusion sur les données à faible différentiel: Plus on a de réplicatset plus l étude est fiable et robuste Il faudrait au minimum 4 réplicats Les résultats «déroutants» observés grâce aux diagrammes de Vennainsi que les résultats sur le rééchantillonnagesont sûrement dûs à l absence d effet biologique Etude à confirmer: Avec un jeu de données comportant au moins 4 réplicatset qui ait des gènes différentiellementexprimés (avec une p value corrigée). Pas facile à trouver -> solutions: -Données simulées -Données réelles fort différentiel (4 réplicats biologiques) 19

20 Jeu de données issu du laboratoire GenPhySE INRA Auzeville(Agnès Bonnet) comportant 2 conditions avec chacune 4 réplicats biologiques Organisme: Brebis Séquenceur: Illumina Hiseq 2000 Problématique: Etude de l'expression des gènes au cours des stades précoces de la folliculogenèseovarienne chez les mammifères de rente (Brebis) Data fort différentiel 20

21 On compare les deux conditions suivantes: Granulosa Stade secondaire VS Ovocyte Stade secondaire Les deux conditions sont très différentes l une de l autre: on est sûr d avoir des gènes différentiellement exprimés Travail avec la p value corrigée à 5% Data fort différentiel 21

22 Toutes combinaisons possibles de 3 réplicatsparmi 4 réplicats idem pour 2 réplicats Informations: -En bleu : les valeurs extrêmes (seuil arbitraire) c est-à-dire inférieures à 4291/2 = 2145,5) Analyse: Moins on a de réplicats, et moins on a gènes DE Importante perte de puissance à partir de 2 réplicats Data fort différentiel 22

23 Exemple: essai 16 4 réplicats 3 réplicats 339 Interprétation: -90% de gènes communs Entre 4 et 2 réplicats(sur nb total de gènes 2 réplicats) -43% de gènes communs Entre 4 et 2 réplicats(sur nb total de gènes 4 réplicats) réplicats Interprétation: -93% de gènes communs Entre 4 et 3 réplicats(sur nb total de gènes 3 réplicats) -62% de gènes communs Entre 4 et 3 réplicats(sur nb total de gènes 4 réplicats) Analyse: Peu de gènes uniques à chaque analyse (4 3 2 réplicats) Data fort différentiel 23

24 3 réplicats p value corrigée = 5% gènes DE sont retrouvés dans les 30 essais effectués Analyse: 780 gènes DE sont retrouvés dans 1 essai seulement Beaucoup de gènes DE retrouvés dans tous les essais «Peu» de gènes DE retrouvés uniquement dans un seul essai Data fort différentiel 24

25 2 réplicats p value corrigée = 5% 841 gènes DE sont retrouvés dans 1 essai seulement Analyse: Peu de gènes DE retrouvés dans tous les essais Beaucoup de gènes DE retrouvés uniquement dans un seul essai 225 gène DE est retrouvé dans 36 essais effectués Data fort différentiel 25

26 Conclusion sur les données à fort différentiel: 2 réplicatsc est c est insuffisant même pour une comparaison de 2 conditions où il est évident que l on a va trouver des gènes différentiellement exprimés Il nous faudrait un jeu de données avec plus de 4 réplicatsafin de pouvoir conclure 26

27 4. CONCLUSION SUR L INFLUENCE DU NOMBRE DE RÉPLICATS Faible différentiel d expression Loterie Simulation pour quantifier le nombre de réplicatsnécessaires en fonction du différentiel Fort différentiel d expression Perte de puissance 27

28 5. PERSPECTIVES Poursuite du travail sur les données simulées Appel à projets Interlabs 2014: Laboratoire Génomique et biotechnologie des fruits (Toulouse) Laboratoire d Ingenieriedes Systèmes Biologiques et des Procédés (Toulouse) Pierre Frasse Matthieu Lauvernier MahomedZouine-Elie Maza Mondher Bouzayen Sophie Lamarre Véronique Le Berre => Lancement de l étude sur au 8réplicats réplicatsbiologiques (comparaison de deux conditions connues) sur la tomate 28

29 Merci pour votre attention 29