GENETIQUE BACTERIENNE : mise en évidence transformation

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1 1 GENETIQUE BACTERIENNE Bactéries très étudiées : : mise en évidence transformation - Utilisation des bactéries comme outils multiplication très rapide grand nb d individus dans volume réduit (A. Philippon 2000, (A. Philippon 2000,

2 2 Applications de la génétique bactérienne - Identification des bactéries : détection, épidémiologie - Mécanismes du pouvoir pathogène - Mécanismes de la résistance aux antibiotiques (ATB) - Biologie moléculaire Utilisation industrielle des bactéries Etude des mécanismes d acquisition de l information bactérienne (mutations, transferts génétiques) I. L ADN BACTERIEN

3 3 1. Chromosomique 1 molécule d ADN circulaire double brin (exceptions) Pas de membrane nucléaire, 1 core central + boucles d ADN (adapté d après Génomes, 2004, Médecine-Sciences, Flammarion) Taille : Mycoplasma genitalium 580 kilopaires de bases (kpb) E. coli 4700 kpb Séquence de génomes bactériens connue pour de très nombreuses bactéries 1 ers génomes bactériens séquencés en 1995 Haemophilus influenzae Mycoplasma genitalium Action d antibiotiques : quinolones, nitroimidazolés

4 4 2. Extrachromosomique : plasmides Petite molécules d ADN circulaires double brin, facultatives. Capables de réplication autonome, souvent autotransférables, parfois capables de s intégrer dans le chromosome bactérien. Cf conjugaison 3. Application au diagnostic bactériologique Hybridation moléculaire : sondes froides ou radioactives. Ex : identification des mycobactéries. Amplification d acides nucléiques. Ex : PCR diagnostique Chlamydia trachomatis. Etude des profils de restriction enzymatique de l ADN en épidémiologie. Ex : comparaison de souches responsables d infections nosocomiales, épidémies de légionellose. Séquençage de gènes ou de portions de gènes après amplification pour identifier la bactérie.

5 5 II. LES MUTATIONS 1. Définition 1.1 Modification de l ADN bactérien Spontanée ou induite, discontinue, stable, rare, spécifique = variation génotypique. 1.2 Caractéristiques Spontanées Indépendantes de l agent sélecteur Ex : Formes variantes préexistantes dans une population bactérienne sélectionnées par l ATB Induites Par des agents mutagènes, génotoxiques (UV, analogues guanine) Discontinues ou brusques Loi du tout ou rien Stables Transmission verticale Mutations reverses (retour phénotype sauvage S) Rares Taux de mutation = probabilité pour 1 bactérie de muter pendant 1 unité de temps définie De 10-5 à 10-10, en moyenne

6 6 Spécifiques, indépendantes Probabilité pour une bactérie de subir simultanément deux mutations distinctes = produit des probabilités individuelles de ces mutations. Exemple : résistance Mycobacterium tuberculosis aux ATB bactéries (A. Philippon 2000, Mécanisme moléculaire Tout ce qui modifie la structure de l ADN 2.1 Mutations ponctuelles Changement d une paire de bases (substitution, délétion, insertion) Conséquences o Mutation silencieuse o Mutation faux sens o Mutation non sens AAA (K) AAG (K) AAG (K) GAG (E) UGC (C) UGA (stop)

7 7 (adapté d après Génomes, 2004, Médecine-Sciences, Flammarion) 2.2 Addition ou délétion d une ou plusieurs bases Insertion ou délétion de plusieurs bases (microinsertions ou microdélétions) protéine très différente ou pas de protéine.

8 8 III. TRANSFERTS GENETIQUES PRINCIPALES CARACTERISTIQUES 1. Définition Transfert unidirectionnel, d ADN d une bactérie donatrice à une bactérie réceptrice. Transfert total ou le plus souvent partiel (1-2% du génome). Acquisition de gènes, transfert horizontal d information génétique entre les bactéries. Eléments transférables : plasmides, transposons, intégrons. 2. Mécanismes Transformation : ADN libre. Conjugaison : contact entre bactéries, plasmides. Transfert par bactériophage : - transduction - conversion lysogénique. Transposons et intégrons.

9 9 3. Résultats : devenir d un ADN exogène après son transfert 3.1 Substitution de matériel génétique Intégration dans zone complémentaire chez la bactérie réceptrice = recombinaison homologue ou légitime. Appariement entre 2 segments d'adn présentant des homologies de séquence et recombinaison. (adapté d après Microbiologie générale, 1995, Doin éditeurs) 3.2 Addition de matériel génétique Absence d homologie = absence de recombinaison homologue. Intégration dans zone non homologue transposons (recombinaison illégitime) bactériophages (conversion lysogénique) (adapté d après Microbiologie générale, 1995, Doin éditeurs)

10 10 (adapté d après Génomes, 2004, Médecine-Sciences, Flammarion) Pas d intégration mais réplication autonome : plasmides, bactériophages. (adapté d après Microbiologie générale, 1995, Doin éditeurs) Pas d intégration, ni réplication : perte pour la descendance. (adapté d après Microbiologie générale, 1995, Doin éditeurs)

11 11 IV. LA TRANSFORMATION BACTERIENNE 1. Mise en évidence GRIFFITH (1928) 1 er modèle connu de transfert d ADN, fixé et absorbé par des bactéries réceptrices, dites compétentes. Smooth Rough Smooth (A. Philippon 2000, Principe transformant AVERY, Mc LEOD, Mc CARTHY (1944) Principe transformant = ADN, support de l hérédité.

12 12 2. Mécanisme Caractères transmis Variés, en petit nombre (1-2% du génome). Fréquence de transfert 10-4 à Bactéries réceptrices ADN nu, exogène, libéré d une bactérie qui se fixe sur une bactérie réceptrice en état de compétence. Pénétration à travers la paroi bactérienne via des pores et appariement avec les régions homologues (recombinaison homologue). JP Euzeby, 2006

13 13 3. Différentes variétés, applications Transformation naturelle Quelques espèces (pneumocoque, méningocoque etc..) Entre bactéries de même espèce ou espèces voisines Ex : acquisition de la résistance à la pénicilline G chez le pneumocoque. oraux (A. Philippon 2000,

14 14 Transformation artificielle Création d un état de compétence = perméabilisation des enveloppes : - électrique : électroporation - chimique Utilisation pour transfert de gènes Directement ou portés par un vecteur le plus souvent (plasmides) Technique de base génie génétique, Biologie moléculaire V. CONJUGAISON BACTERIENNE 1. Mise en évidence Expérience de Tatum et Lederberg (1946) (A. Philippon 2000, Mutants auxotrophes de E. coli

15 15 Mécanisme - Contact entre bactéries Processus sexuel - Polarité dans les échanges bactéries donatrices males ou F+ bactéries réceptrices femelles ou F- - Caractère donneur lié à la présence d un plasmide, le «facteur F» (fertilité), chez la bactérie donatrice ou male : - libre +++, réplication autonome (bactérie F+) - ou intégré dans le chromosome bactérien (bactérie Hfr) - gènes codant pour sa réplication, pour son transfert et pour la synthèse de pili sexuels accolement des bactéries, formation d un pont cytoplasmique et échange de matériel génétique. Plasmide F Opéron tra : synthèse des pili sexuels, exclusion de surface, transfert de l ADN, régulation orit : origine de transfert oriv : origine de réplication (adapté d après Bacteria versus antibacterial agents, 2003, ASM Press)

16 16 2. Transfert de l ADN plasmidique Plasmides (Facteur F) non intégrés = ADN double-brin circulaire, extra-chromosomique, sous forme libre, taille variable (0,5-500 kb). Différents modèles de réplication. JP Euzeby, 2006 Différents types de plasmides selon leur transférabilité (plasmides conjugatifs, plasmides mobilisables). Propriétés codées par les gènes plasmidiques : - Facteurs de résistance aux ATB ++ et antiseptiques - Production de toxines et adhésines - Propriétés métaboliques. Conjugaison : mode habituel de transfert de plasmides (plasmides conjugatifs) chez bactéries Gram (-), espèces voisines ou. Spécificité d hôte variable selon le type de plasmides, étroite ou large.

17 17 (A. Philippon 2000, Transmission horizontale des plasmides, entre bactéries de la même espèce voire d espèces différentes par : - Conjugaison (Gram (-)) - Transduction (Gram (+))

18 18 3. Transfert de l ADN chromosomique JP Euzeby, 2006 Plasmide (Facteur F) intégré, intrachromosomique, porte les gènes pour le transfert de l ADN chromosomique : bactérie dite «Hfr» pour «Haute Fréquence de Recombinaison». Transfert d ADN chromosomique à sens unique, orienté, progressif, rarement total (2 h de contact), le plasmide passant en dernier. Quantité d ADN transférée fonction du temps de contact. 1 brin d ADN transféré (monocaténaire). Restauration du brin non transféré par réplication. Intégration dans le chromosome de la bactérie réceptrice si homologie (même espèce bactérienne). Acquisition de propriétés de la bactérie donatrice Transfert d'adn chromosomique avec recombinaison homologue entre bactéries de même espèce, chez les bactéries Gram (-) telles E. coli, Salmonella et aussi chez les streptocoques. Facteur F intégré peut s exciser du chromosome.

19 19 (A. Philippon 2000, Application : carte génétique de E. coli, circularité du chromosome bactérien.

20 20 V. TRANSFERT PAR DES BACTERIOPHAGES - Transduction = Transfert d ADN partiel par les bactériophages (vecteurs) entre bactéries de même espèce. Chez bactéries Gram (+) et Gram (-). - Conversion lysogénique 1. Les bactériophages Structure - 1 acide nucléique protégé par 1 coque (A. Philippon 2000, - lyse bactérienne = phages virulents - lysogénie = phages tempérés - Transfert d'adn bactérien = phénomène accidentel au cours de l'infection phagique

21 21 Action sur les bactéries (C. Bébéar)

22 22 2. Mécanismes de transduction Transduction généralisée (phage virulent) Introduction de n importe quel fragment d ADN bactérien (C. Bébéar)

23 23 Transduction restreinte (phage tempéré) Exemple du phage lambda intégré dans le chromosome bactérien : transfert du fragment adjacent à l ADN du phage. (C. Bébéar)

24 24 Applications de la transduction Transmission d ADN bactérien ou de plasmides (Gram (+)), de taille limitée (taille du phage, <50 kb). 3. Conversion lysogénique Génome de bactériophage intégré (prophage) dans le chromosome bactérien = état lysogène Propriété nouvelle apporté par le génome du prophage. Exemple : gène tox de la toxine diphtérique chez le bacille diphtérique, apporté par un phage (souches toxinogènes). (adapté d après Bacterial pathogenesis, 2 nd edition, 2002, ASM Press)

25 25 VI. TRANSPOSONS et INTEGRONS TRANSPOSONS (Tn) 1. Définition Séquences d'adn mobiles pouvant se déplacer d'un site à un autre de l'adn (chromosome ou plasmide, sur même ADN ou non) sans jamais apparaître sous forme libre = «gènes sauteurs». Pas de réplication autonome. Conjugaison Séquence d ADN pouvant s intégrer à partir d un plasmide ou chromosome dans un autre plasmide ou chromosome. Transduction Transformation Dissémination des gènes de résistance

26 26 2. Propriétés (plasmides, phages, ADN nu, Tn) Excision puis Intégration par recombinaison illégitime : pas besoin d'homologie génétique entre le Tn et le site d'insertion addition d ADN sans homologie. Transposition réplicative «copier-coller» ou conservative «couper-coller». (adapté d après Génomes, 2 nd édition, 2004, Flammarion, Médecine-Sciences) Gènes codant pour : - leur propre transposition (enzyme responsable = transposase) - résistance aux ATB - gènes de virulence Plusieurs types de Tn: - les plus simples: séquences d'insertion "IS", extrémités identiques avec séquences inverses répétées (IR, Figure (a))

27 27 - les plus complexes: véhiculent d'autres gènes que ceux nécessaires à leur transposition, (Figure (b)) (adapté d après Bacteria versus antibacterial agents, 2003, ASM Press) 3. Rôle Rôle des Tn dans la plasticité du génome bactérien, dans l expression des gènes, dans l amplification et dispersion des gènes de résistance aux ATB. Tn=agent mutagène par insertion : - Réarrangements génomiques - Propriétés additionnelles portées par les gènes du Tn (R ATB, gènes de virulence) - Utilisés en biologie moléculaire (mutagénèse aléatoire par transposition) INTEGRONS Intégron Intégrase Cassette de gène

28 28 Système naturel de capture et d expression des gènes sous forme de cassettes. Cassettes : éléments génétiques mobiles capables d être intégrés et excisés par un mécanisme de recombinaison site-spécifique, médié par une intégrase. Fonctions : gènes de résistance aux antibiotiques. Cassette 1 intégrée Intégrons, incapables d auto réplication, immobiles, pas transposables par eux-mêmes mais résidant sur des éléments mobiles, plasmides ou Tn. Majoritairement chez les bactéries Gram (-).

29 29 VII. APPLICATION : GENIE GENETIQUE, BIOTECHNOLOGIES Introduction d un gène eucaryote (insuline, interféron, somatostatine, antigènes pour vaccins) dans un vecteur (plasmide ou bactériophage) grâce à des enzymes de restriction et ligase. Introduction du vecteur porteur du gène dans une bactérie ou une levure : synthèse du produit.