Diagnostic de la rage en laboratoire. Christine Fehlner-Gardiner, Ph.D. Chercheuse scientifique, Centre d expertise de la rage - ACIA

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1 Diagnostic de la rage en laboratoire Christine Fehlner-Gardiner, Ph.D. Chercheuse scientifique, Centre d expertise de la rage - ACIA

2 Structure de gouvernance - ACIA L ACIA relève du ministre de l Agriculture, mais se distingue du ministère de l Agriculture Trois directions générales Programmes Politiques et réglementation Opérations Exécutions des programmes : Inspection et application de la loi Science Analyses et recherche 2

3 Centre d expertise de la rage - ACIA Équipe de chercheurs, de techniciens et de diagnosticiens Laboratoires et installations vétérinatires de niveau de bioconfinement 2 et 3 Certification ISO Deux laboratoires de diagnostic: Ottawa ON et Lethbridge AB Centre collaborateur OMS-OPS Lethbridge, AB Laboratoire de référence OIE Ottawa, ON Responsable: Dr. Alex Wandeler 3

4 Centre d expertise de la rage - ACIA Activités pricipales Diagnostic et identification de la souche Animaux suspects ayant eu des contacts avec des humains ou des animaux de compagnie Cas suspects humains Typages antigénique et moléculaire du virus Soutien aux efforts de lutte contre la rage des gouvernements provinciaux Développement de la recherche et des technologies Biologie de la rage Mise au point de méthodes Recherche sur la vaccination orale 4

5 Centre d expertise de la rage - ACIA Activités pricipales Services-conseils à l échelle nationale et internationale Centre collaborateur OMS-OPS Formation de scientifiques invités en techniques de diagnostic et de recherche Conservation de collections de virus de référence et d anticorps monoclonaux Participation aux initiatives de recherche internationales, p. ex.,» Project de l OMS sur les anticorps monoclonaux thérapeutiques en remplacement des immunoglobulines antirabiques d origine humaine (HRIG) ou équine (ERIG)» Caractérisation des lyssavirus à distribution mondiale Laboratoire de référence OIE Participation à des panels d évaluation de la compétence à l échelle internationale pour le diagnostic de la rage 5

6 Pourquoi mettre sur pied un laboratoire de diagnostic? Double objectif du diagnostic de la rage: faciliter la prise de décision en ce qui concerne la nécessité de traitement préventifs postexpositions; effectuer la surveillance nécessaire dans le but d établir un programme de lutte contre la rage et suivre son évolution. 6

7 Méthodes diagnostiques pour le détection de la rage dans les laboratoires spécialistes de l ACIA Prélèvement d échantillons par les bureaux de district de l ACIA Envoi des échantillons aux laboratoires par autobus, par service de messagerie privé, par avion Épreuves effectuées: Immunofluorescence résultats obtenus dans les 24 heures Presque tous les échantillons reçus sont analysés à l aide de cette épreuve Épreuve d inoculation de cultures de tissus pour le détection de la rage résultats obtenus en 5 jours Une épreuve de confirmation est effectuée pour tous les échantillons ayant réagi négativement à l immunofluorescence, lorsque des humains ont été exposeés à la maladie Immunocytochimie résultats obtenus en 5 à 10 jours Des tissus fixés au formaldéhyde sont utilisés 7

8 Laboratoire de détection de la rage de l ACIA - Salle d examen post-mortem 8

9 Outils et vêtements de protection utilisés lors de traitement des échantillons suspects 9

10 Contenants d expédition utilisés par l ACIA 10

11 Immunofluorescence Les échantillons doivent être frais ou congelés Parties du cerveaux recommandées: bulbe rachidien (y compris la protubérance), hippocampe et cervelet Une portion de la moelle épinière doit être ajoutée si: le cerveau est fortement endommagé l échantillon est d origine bovine ou équine l animal a été abattu au début de l infection dès les premiers soupçons Des témoins positifs et négatifs sont analysés en parallèle Des panels d anticorps monoclonaux peuvent être utilisés pour distinguer les variantes 11

12 Procédure normalisée pour l immunofluorescence 1. Utiliser des instruments propres pour chaque animal, retirer le cerveau de crâne et le placer sur une assiette en carton. 2. À l aide d un couteau en plastique jetable, prélever des morceaux du bulbe rachidien, de l hippocampe et du cervelet. 3. Préparer un calque d organe pour chaque partie du cerveau, de même que pour un mélange de tissus (4 calques au total, 2 par lame porte-objet) 4. Inactiver le virus en exposant les lames à des rayons UV. 5. Fixer les lames dans de l acétone froid. 6. Les laisser sécher à l air, puis appliquer quelques gouttes d un solution des anticorps antirabiques immunofluorescents et incuber. 7. Nettoyer les lames à l aide d une solution saline tamponnée au phosphate. 8. Appliquer le milieu de montage et les lamelles couvre-objet. 9. Observer à l aide d un microscope à fluorescence. 12

13 Ouverture du crâne pour le prélèvement de l échantillon 13

14 Cerveau à découvert avant son prélèvement 14

15 Cerveau prêt pour la préparation des calques d organe 15

16 Préparation des calques d organe qui serviront à l immunofluorescence 16

17 Coloration des calques avec un conjugé fluorescent antirabique 17

18 Microscope à fluorescence 18

19 Résultats de l imunofluoresence Résultat negatif Résultat positif Paramètres pour l interprétation des résultats qui peuvent porter à confusion: autofluorescence du tissu Artéfacts de coloration (p. ex., conjugué qui a séché, nettoyage insuffisant des lames porte-objet, présence de bactéries dans les échantillons 19

20 Immunofluorescence typage antigénique avec anticorps monoclonaux AcM Utilisation d un panel de 16 anticorps monoclonaux pour différencier quatre souches du virus de la rage trouvée au Canada 1C5-5-2! 5DF12* 11DD1 M1329 M BH11 20CB11 24FF11 M993 26AF11 26BD6 32FE10 32FF1 38FG5 M1347 7D2-7-4 Renard artique Negatif Moufette de l Ouest Raton laveur, région atlantique centrale Positif Vaccin ERA 20

21 Épreuve d inoculation de cultures de tissus pour la détection de la rage Épreuve effectuée sur tous les échantillons ayant donné des résultats négatifs à l immunfluorescence pour les cas où il y a eu exposition humaine Cette épreuve remplace l inoculation à la souris. Suspension de tissus cérébraux préparée et inoculée dans des cultures de cellules de neuroblastome de souris. Témoins positifs et négatifs analysés en parallèle. Cultures examinés par immunofluorescence directe après une période d incubation de 5 jours. 21

22 Épreuve d inoculation de cultures de tissus pour la détection de la rage Préparation de suspensions de tissus Inoculation de cultures cellulaires Résultat positif 22

23 Diagnostic ante mortem des cas de rages chez des humains Biopsie cutanée : Prélèvement à la limite du pelage derrière le cou de manière à inclure quelques follicules pileux Coupe congelées découpées et traitées conformément aux méthodes de préparation des échantillons pour l immunofluorescence Tissu servant également à réaliser une amplification de la polymérase après transcription inverse (RT-PCR nichée) Échantillon de salive Isolement du virus avec épreuve d inoculation de cultures cellulaires et RT-PCR Autres échantillons possibles Empreintes cornéennes - immunofluorescence Rinçage oculaire RT-PCR 23

24 Diagnostic ante mortem des cas de rages chez des humains exemples des résultats Immunofluorescence après biopsie cutanée nucale RT-PCR avec des échantillons cutanés et salivaires Gène N Gène P Sk Sa Neg Cntls P1 P2 Sk Sa Neg Cntls P1 P2 24

25 Programme de formation de l ACIA sur le diagnostic de la rage L ACIA offre un programme complet de formation sur les méthodes d épreuve et l analyse des résultats au personnel des laboratoires de détection de la rage. Immunofluorescence pour recevoir la certification d analyste, il faut faire des lectures des résultats d analyses de 2000 échantillons, dont 5% doivent être positifs. Le technicien doit réussir deux épreuves de compétence avant de pouvoir poser des diagnostics. Les diagnosticiens certifiés subiront des épreuves de compétence sur une base régulière (4 panels d épreuves par année). Ils doivent les réussir pour conserver leur certification. Nous avons également donné de la formation à des collègues étrangers (Indonésie, Nigeria, Zimbabwe, Afrique du Sud, Kenya, Inde) 25

26 Qu est-ce que le Centre d expertise de la rage de l ACIA peut offrir au projet de CTP en Haïti? 1. Des consultations et de conseil sur l établissement du laboratoire de diagnostic de la rage à Haïti. 2. De la formation au personnel du laboratoire d Haïti sur le rendement et l analyse des épreuves de diagnostic de la rage. 3. Des réactifs comme anticorps antirabique fluorescent ou anticorps monoclonaux pour faire le typage de souche. 26

27 Établissement d un laboratoire de diagnostic de la rage Exigences minimales: Système d acheminement des échantillons au laboratorie, dont des contenants d expéditions ainsi que des directives pour les employés sur le terrain. Nombre suffisant d outils et d instruments pour ouvrir les crânes afin d eviter la contamination croisée des échantillons. Équipement de protection personnelle pour les employés (p. ex. gants, sarraus, écrans faciaux). Lampe UV. Réfrigérateur et congélateur (peuvent être combinés en un seul appareil). Microscope à fluorescence. Récipients pour l incubation des lames portants des anticorps et pour le nettoyage des lames. Matériel: lames porte-objet, lamelles couvre-objet, boites à Pétri, acétone, anticorps antirabique fluorescent, réactifs pour la préparation de solution tampon, solution désinfectante. 27

28 Formation du personnel a. On propose que dans un premier temps, un ou deux employés d Haïti visitent notre laboratoire d Ottawa pour recevoir une formation sur les techniques de diagnostic et l analyse. b. Ces employés veilleront ensuite à ce que les connaissances qu ils ont acquises soient appliquées dans leur laboratoire en Haïti. c. Un employé du laboratoire d Ottawa pourra, dans un deuxième temps, se rendre au laboratoire d Haïti afin d aider à la mise en application des nouvelles compétences. d. La participation continue prendra ensuite la forme de partage d échantillons pour l évaluation des compétences, d élaboration de stratégies pour le typage du virus et d autres projets de collaboration. 28

29 Merci beaucoup pour votre attention. Je vais essayer de répondre à vos questions. 29

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