La PCR en temps réel

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1 La PCR en temps réel Hôpital La Rabta Tunis 6 juin 2013 Dr Sabine Favre-Bonté Maître de Conférences, Université Claude Bernard Lyon 1 UMR CNRS 5557 Ecologie Microbienne Equipe Multi-résistance environnementale et Efflux bactérien

2 Pourquoi utiliser la PCR en temps réel? Culture = méthode de référence Sensible Obtention des souches : analyse phénotypique, antibiogramme Large spectre d infection mise en évidence Faible coût Limites des méthodes par culture Micro-organismes à croissance lente et/ou difficile voire impossible (bactéries intracellulaires) Perte de viabilité durant le transport des prélèvements Traitement préalable par des antibiotiques 24 à 72 h = temps moyen incompressible pour l identification par les méthodes phénotypiques Alternatives : méthodes moléculaires Principe : Détection / identification directe par PCR d ADN bactérien dans des prélèvements biologiques

3 PCR en temps réel La réaction d amplification de la séquence ADN cible suit les mêmes étapes qu une PCR classique A la différence d une PCR classique, la PCR en temps réel utilise une sonde fluorescente qui permet la quantification et la caractérisation de l amplicon formé en temps réel

4 Historique 1992 : Russell Higuchi qui analyse la cinétique de la PCR «en temps réel» Système utilisé : Bromure d éthidium (BET) comme agent intercalant Thermocycleur modifié pour stimuler l émission des échantillons par rayonnements UV Détection de la fluorescence par une caméra CCD (charge-coupled device)

5 PCR conventionnelle Méthode d amplification d une cible spécifique d ADN suivie d une étape de révélation sur gel d électrophorèse Extraction (manuelle ou automatisée) Amplification Révélation par électrophorèse sur gel d agarose et visualisation sous UV

6 Principe de la PCR en temps réel Amplification et détection synchronisée : rapidité! Système fermé, pas de manipulation post amplification, faible risque de contamination Basée sur détection d un rapporteur fluorescent : - Génération de fluorescence : Agent se liant à l ADN double brin : SYBR Green I Sondes marquées (FRET, Taqman, Molecular beacons, ) - Signal proportionnel à la quantité d amplicons Se réalise dans un thermocycleur rapide couplé à un spectrofluorimètre piloté par un ordinateur (e.g. LightCycler, Roche)

7 La réaction Master Mix (Taq polymérase, dntps, amorces, MgCl2, H20, SYBR Green ou sondes fluorescentes) + ADN à amplifier

8 PCR conventionnelle vs PCR en temps réel

9 Quantification Ligne de base : bruit de fond de fluorescence Ligne seuil : au dessus de laquelle la variation de fluorescence suit une loi exponentielle Cycle seuil ou Ct ou Cp : Point d intersection de la courbe PCR avec la ligne seuil et qui est directement lié à la quantité de cible dans l échantillon Nb de cycles d amplification nécessaire pour obtenir un signal fluorescent statistiquement significatif par rapport au bruit de fond (valeur seuil)

10 Génération de fluorescence au cours de l amplification par : 1. Emission de fluorescence par un agent intercalant (ex : SybrGreen ) 2. Fluorescence par transfert d énergie de résonance (FRET) 3. Libération de fluorescence par : - l activité 5-3 exonucléase de la Taq polymérase (ex : TaqMan ) - l hybridation d une sonde (ex : Molecular Beacon )

11 Agents intercalants (SYBR TM Green) Avantages : Simple Fluorescence proportionnelle à masse de l ADN (= taille amplicon) Très sensible Limites : Spécificité : marquage de tous les ADNs doubles brins (spécifiques ou non dimère d amorces) mais possibilité Établissement de la courbe de fusion post-pcr

12 Le SYBR Green I

13 Le SYBR Green I Caractérisation de l ADN double brin synthétisé par sa température de fusion (Tm) Obtenue par réalisation d une courbe de fusion : Augmentation de la température Dissociation de l ADN double brin Diminution progressive de la fluorescence Quand 50% de l ADN double brin est dissocié, chute brutale de la fluorescence

14 SYBR Green I Se lie à ADN par mécanisme de liaison non défini, émission de fluorescence augmente lorsqu il est lié à l ADN double brin En solution émet peu de fluorescence Durant élongation, se fixe sur ADN double brin naissant entrainant augmentation de fluorescence ; émission décroit lorsque ADN est dénaturé à l étape suivante Émission de fluorescence mesurée à la fin de chaque cycle d élongation Spécificité repose entièrement sur les amorces

15 Avantages Économique Facile d utilisation SYBR Green I N est pas affecté par mutations dans ADN cible qui influence l hybridation de sondes spécifiques Inconvénients Spécificité des amplicons à vérifier (Identité du produit PCR via sa température de fusion, dépôt sur gel) Se fixe à n importe quelle molécule d ADN double brin (mauvais appariements, dimères d amorces,..)

16 FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer Principe basé sur utilisation de 2 sondes linéaires complémentaires d une séquence cible Sondes marquées : Une en 3 par marqueur fluorescent qui émet une fluorescence verte à faible longueur d onde Une en 5 par un fluorochrome accepteur (LC red640), émission de fluorescence rouge Hybridation «tête à queue» sur l ADN proximité des fluorochromes, transfert d énergie : fluorescence rouge

17 Chimie FRET Lors de l hybridation de 2 sondes (e.g. LightCycler hybridization probes) sur leur séquence cible conduisant à un rapprochement des fluorophores. Lors de l étape d élongation, les sondes sont décrochées mais non dégradées.

18 Principe de la chimie des sondes FRET

19 Avantages : Pas d hydrolyse : Sondes FRET Émission de fluorescence réversible Production d une courbe de fusion post-pcr Limites : Dans le choix du coupe de fluorophores, ce qui limite à 2 cibles maximum

20 Libération de fluorescence : l activité 5-3 exonucléase de la Taq polymérase s exerçant sur une sonde (e.g. TaqMan ) dont la dégradation, au cours de l élongation du fragment PCR, permet de lever l action inhibitrice d un quencher sur un fluorophore l hybridation d une sonde (e.g. Molecular Beacon, QuantiProbe ) lors de son hybridation sur sa séquence cible conduit à la levée, par éloignement, de l action inhibitrice d un quencher sur un fluorophore. Lors de l étape d élongation, la sonde est décrochée mais non dégradée.

21 Les sondes fluorogéniques Définition ADN monobrin Non extensible par ADN polymérase Spécifique du fragment cible amplifié Portant 1 ou 2 groupements fluorophores

22 Sondes d hydrolyse : TaqMan Principe basé sur l activité 5 exonucléasique de Taqpolymérase pour hydrolyser une sonde pendant l étape d élongation de la PCR Fluorochrome émetteur (reporter ou DYE) en 5 Fluorochrome suppresseur (quencher) en 3

23 Principe de la chimie TaqMan

24 Chimie TaqMan

25 Sonde d hydrolyse ou TaqMan Sonde clivée que si hybridée à son brin complémentaire Clivage de la sonde définitive pas de possibilité d établir une courbe de fusion post- PCR (sondes dégradées au fil des cycles)

26 Les sondes d hybridation

27 Sondes BeaconTM ou sondes d hybridation phare Sondes d hybridation en épingle à cheveux appelée balise moléculaire Une boucle : séquence complémentaire d une séquence cible de l ADN Deux bras de séquences complémentaires Un fluorochrome émetteur (e.g. FAM, TAMRA, TET, ROX) Un fluorochrome suppresseur (e.g. DABCYL), chromophore non fluorescent dissipe en chaleur l énergie de l emetteur (FRET)

28 Chimie Beacon

29 Molecular beacons : balises moléculaires

30 Avantages de la PCR en temps réel avec sondes très spécifique (car cette PCR nécessite l utilisation de deux amorces et d une ou plusieurs sondes spécifiques) possibilité de faire des multiplexes i.e. plusieurs PCR dans le même tube : détection de fluorochromes différents indicateurs de PCR différentes dans le même tube quantification relative directe, meilleure normalisation.

31 Limites de la Q-PCR avec sondes coût des sondes (surtout si nombreux gènes différents à quantifier)

32 Avantages / inconvénients de la PCR en temps réel SYBR Green FRET TaqMan Molecular beacons Avantages Économique, facile à utiliser, sensible Spécificité accrue, capacité de multiplexage Flexibilité dans le dessin des amorces, sondes réutilisables à chaque cible pour FRET Très spécifique détection de SNPs (single nucleotide polymorphisms) Inconvénients Se lie à n importe quel double brin d ADN faux positifs Moins efficace et moins flexible pour la détection de mutations spécifiques Difficulté du dessin des sondes d hybridation

33 Réalisation des expériences de PCR en temps réel Attention au transfert des conditions expérimentales de PCR en PCR en temps réel! Ce n est pas parce que les paramètres sont optimisés en PCR conventionnelle qu ils sont transférables en PCR en temps réel Optimisation des conditions de réactionnelles rendue difficile avec l usage des kits

34 PCR en temps réel : conseils d optimisation Notion d efficacité

35 Facteurs influençant la PCR en temps réel

36 Facteurs influençant la PCR en temps réel

37 Facteurs influençant la PCR en temps réel

38 Dessin des amorces

39 Rôle du magnésium

40 PCR en temps réel : les pré-requis

41 PCR en temps réel : les additifs

42 Exemple d optimisation : choix de la Taq polymérase

43 Exemple d optimisation : Pureté des amorces

44 Exemple d optimisation : température d hybridation

45 Limites de la PCR en temps réel Mêmes que PCR conventionnelle Transformer échantillon (ex : 25 g si aliment) en volume compatible (10-50 ml) en conservant 100 % ADN initial Détection de cellules non viables Coûts Thermocycleur 30 à $ Réactif jusqu à 25 $ pour un essai Difficulté de conception des sondes

46 Exemples d Appareils CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System / BIORAD LightCycler LC480 / Roche TLDA 7900 / Applied Biosystems Mx4000 / Stratagene qtower / Eurobio...

47 Avantages de la PCR en temps réel et place en bactériologie Rapidité Spécificité Sensibilité Faible risque de contamination «Moindre coût» Place : Diagnostic d urgence Facilité de mise en œuvre Identification de germes non cultivables ou difficilement identifiables par techniques conventionnelles

48 Nouvel outil : droplet digital PCR

49 ddpcr Détection et quantification absolue par PCR en émulsion: ATTENTION - détermine nombre de copies sans courbe étalon - détecte de très faibles différences de concentration de cibles - augmente la capacité de détecter de rares copies Il ne s agit pas de PCR en temps réel à haut débit C est un système complémentaire de la qpcr standard où les aspects de sensibilité et de précision sont des critères déterminants.

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58 ddpcr : avantages Signal augmenté : Nombre de copies cibles élevé et le bruit de fond sont dilués et les cibles rares sont enrichies (précision+/- 10%). Biais de la PCR supprimés : Les barres d erreur sont réduites et de petites différences sont détectables. Quantification simplifiée : Pas de nécessité de standards de calibration. Coût des réactifs réduit : Réactions en pl ou nl réduisant les réactifs et la quantité d échantillon de départ.

59 ddpcr : applications émergentes Copy Number Variation (CNV) : CNVs résultent de trés peu de différence de dosage de gènes responsables de variation phénotypiques, Detection de séquences rares : Amplifier un gène unique dans un échantillon complexe (cellules tumorales, ). ddpcr est assez sensible pour détecter des mutations ou des séqeunces rares Expression de gènes et l analyse de mirna : ddpcr permet de la quantification absolue de niveaux d expression (ARNm en faible abondance) avec une sensibilité et une précision élevées. Next Generation Sequencing (NGS) : Quantifier les préparations d échantillons NGS pour augmenter efficacité de sequençage et réduire le nombre de runs. Peut aussi être utilisée pour standardiser des standards internes de tests de PCR en temps réel..

60 Merci pour votre attention