Détection de mutations somatiques par NGS sur GAIIx

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1 Détection de mutations somatiques par NGS sur GAIIx Aude Lamy Laboratoire de Génétique Somatique des Tumeurs CHU de Rouen Inserm U1079 Faculté de Médecine et Pharmacie de Rouen

2 La médecine personalisée aujourd hui

3 ZOOM sur l adénocarcinome du poumon En un seul temps, 7 analyses 16 points de mutations sur 4 gènes Délétions/insertion/duplication 3 exons, 2 gènes Analyse exhaustive des exons 18 à 21 de l EGFR Prélèvements souvent de petite taille (biopsies bronchiques) et peu riche en cellules tumorales!!!

4 Apports du NGS Séquençage Sanger Séquençage d un exon Séquençage NGS Séquençage en parallèle des exons de plusieurs gènes Séquençage en parallèle de tous les exons du génome Séquençage en parallèle de tout le génome Séquençage simultané de millions de fragments d ADN

5 Schéma de l étude 17 régions cibles de valeur prédictive de réponse à une thérapies ciblée ADNg extrait provenant de 12 patients étudiés pour une ou plusieurs de ces régions cibles et présentant des altérations représentative des régions étudiés (mutations ponctuelles, délétion, insertion/duplication). Séquençage haut débit par technologie illumina Objectifs : Évaluer la faisabilité du séquençage haut débit pour des échantillons FFPE tout venant. Comparaison des résultats Génotype de référence

6 Méthodologie Amplification et purification des régions cibles Dosage et réalisation de pools équimolaires Fragmentation par sonication

7 Méthodologie Fixation des adaptateurs et index et purification sur billes sans sélection de taille PCR d enrichissement

8 Méthodologie Patient 1 Patient 2 Patient 12 Index 1 Index 2 Index 3 à 11 Index 12 Immobilisation et amplification clonale des fragments sur la flow cell 1/10 ème ligne 1/80 ème Flow Cell Profondeur : 1000

9 Méthodologie Réalisation du séquençage et alignement des lectures sur le génome humain

10 Résultats préliminaires Visualisation des fichiers bam à l aide du logiciel Alamut Analyse sur les gènes ciblées Premier niveau d analyse : la profondeur de lecture KRAS Exon 2 Profondeur de lecture

11 Résultats préliminaires Analyse de la profondeur de lecture en fonction de la taille des amplicons La profondeur de lecture augmente avec la taille de l amplicon Perte des fragments de petites tailles lors de la préparation de la librairie

12 Résultats préliminaires Second niveau d analyse : analyse des reads (lecture des fragments) read Mutation KRAS c.35g>a détectée sur 25 des 87 lectures correspondant à cette position (29%)

13 Résultats préliminaires Second niveau d analyse : analyse des reads (lecture des fragments) read Zone affectée par la sonication Délétion au niveau de l exon 19 de l EGFR c.2236_2257delinsatct

14 Résultats préliminaires 14 altérations recherchées 8 mutations ponctuelles 2 insertions/duplications 4 délétions 13 altérations identifiées par séquençage illumina

15 Résultats préliminaires : échantillon GS mutation PIK3CA c.1633g>a non identifiée Mutation PIK3CA c.1633g>a détectée sur 2 des 58 lectures correspondant à cette position (2%)

16 Résultats préliminaires : échantillon GS Détection de la mutation PIK3CA c.1633g>a par SNaPshot PIK3CA 1633R c.1633g>a Prélèvement riche en cellules tumorales

17 Résultats préliminaires : échantillon GS Mutation KRAS c. 38G>A détectée sur 25 des 110 lectures (23%) pour le même prélèvement!

18 Résultats préliminaires : échantillon GS12.114B 1 mutation PIK3CA c.1624g>a non recherchée en routine identifiée par séquençage illumina Mutation KRAS c. 38G>A détectée sur 15 des 103 lectures (15%). Mutation PIK3CA c.1624g>a détectée sur 18 des 112 lectures (16%).

19 Résultats préliminaires : échantillon GS12.114B 1 mutation PIK3CA c.1624g>a identifiée par NGS confirmé par SNaPshot c.1624g>a

20 Conclusion et Perspectives Résultats préliminaires montrant la faisabilité de l utilisation du NGS pour séquencer plusieurs régions cibles d un ADN extrait de blocs FFPE tout venant. A venir : Variant calling illumina : analyse paired-end par défaut du logiciel casava non adapté à la taille des amplicons. Relance en single read ou logiciel alternatif. Réalisation d une comparaison des résultats NGS illumina et ion torrent. Préparation des librairies : concaténation et fragmentation par digestion enzymatique

21 La médecine personnalisée demain!!!

22 Remerciements Laboratoire de génétique somatique des tumeurs Pr Jean-Christophe Sabourin Inserm U1079 Plateforme NGS Pr Thierry Frébourg Isabelle Tournier Françoise Charbonnier Sophie Coutant Plateforme de séquençage de Lille Martin Figeac

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