Suite : Les microscopes électroniques. Le microscope électronique à transmission

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1 Suite : Les microscopes électroniques Le microscope électronique à transmission Pouvoir séparateur de 0,2 nm Description Principe de fonctionnement Techniques appliquées : Technique des coupes minces + coloration positive / Technique cytologique Technique d autoradiographie Technique de coloration négative

2 Echelle d observation du vivant

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4 MET

5 Schéma MET en coupe p.24 Filament émetteur d é

6 Intérêt du MET Un pouvoir de résolution de 0,2 nm ( 2 Å ) A permis de découvrir l ultrastructure de la cellule révélant, avec précision l existence d organites cellulaires : noyau, mitochondries, lysosomes, vacuoles, vésicules, appareil de golgi, RE, ribosomes, centrioles, cytosquelette, chloroplastes.

7 Principe de fonctionnement Observation par transmission

8 Principe de transmission dans le MO et dans le MET Grille en cuivre OEIL

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10

11 MET

12 La microscopie électronique à transmission utilise un faisceau électronique qui traverse une coupe ultra fine de tissu ou de cellule. Le faisceau est ensuite agrandi et projeté sur un écran ou un film sensible.

13 Principe de fonctionnement du MET Source d éclairement Milieu Porte objet 1 er image observation Faisceau d électrons Grille en Lentilles cuivre électromagnétiques Lentilles objectifs Sur écran fluorescent Résultats : image en noir et blanc

14 Techniques appliquées 1 Technique des coupes minces + coloration positive / Technique cytologique p. 29 But : Etude Ultrastructurale de la cellule

15 Le principe et le procédé sont les même que pour la technique histologique, la différence est dans les produits et les outils utilisés. Coupes ultrafines de Å Ultramicrotome sur Coupes étalées sur grille métallique ( en cuivre ) Contraste aux sels de métaux lourds, tel l acétate d uranyl et le citrate de plomb Micrographies en noir et blanc

16 Imprégnation dans de la résine époxy de blocs de résine. obtention blocs de résine

17 Ultramicrotome Coupes ultrafines Å

18 Récupération des coupes sur grille Grille Vaporisation de sels de métaux lourds

19 Contraste positif Les atomes majeurs de la matière biologique sont transparents aux électrons d ou la nécessité d utiliser des sels de métaux lourds.

20 Principe de formation de l image en MET Électrons primaires é arrêtés Coupes ultrafines Électrons transmis

21 Résultats de l observation microscopique après contraste aux sels de métaux lourds Aspect ultrastructural d une cellule

22 Zones claires Ultrastructure d un monocyte sanguin X é transmis Zones sombres opaques aux é é arrêtés Contraste positif

23 Coupe ultrafine du pancréas exocrine x 5000

24 Portion d une cellule hépatique Portion d une cellule glandulaire noyau glycogènes RE mitochondries nucléole Chromatine claire

25 Ultrastructure de la membrane plasmique du globule rouge après coupes minces et coloration positive Résultat : aspect tristratifié de la membrane plasmique

26 Ultrastructure d une mitochondrie / REG Ultrastructure de l appareil de Golgi

27

28 Bactérie x Virus du sida dans la cellule hôte

29 Levure observée au MET noyau vacuole

30 2 La technique d autoradiographie : But : Cinétique d un métabolisme cellulaire Synthèse d une protéine Synthèse des acides nucléiques ADN -ARN Principe : suivi de molécules intracellulaires (protéines,acides nucléiques ) marquées par des isotopes radioactifs tel : le C14, H 3.

31 Procédé de la technique d autoradiographie

32 Les sels de Bromures d argent ( BrAg ) contenus dans l émulsion sont réduits par le rayonnement radioactif et apparaissent sous forme de grains noirs.

33 Principe de la technique d autoradiographie p.34

34 En chambre noire

35 exemple : Localisation de la leucine dans la cellule pancréatique

36 Cinétique de la synthèse et de l emballage des produits de sécrétion

37 Pole apical Pole basal

38

39 Localisation de l ADN / marquage à la thymine radioactif

40 Après 15 minutes G : x minutes Suivi de l Uridine marquée par l isotope radioactif localisation de l ARN

41 Le taux de radioactivité est donc fonction de la quantité de molécules synthétisées.