TP n 4: Le métabolisme du glucose

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1 Nom : Prénom : Classe : TP n 4: Le métabolisme du glucose Toutes les cellules sont le siège de nombreuses réactions chimiques qui leur permettent de croître et de se diviser. Ces réactions nécessitent de l énergie libérée par l hydrolyse de molécules comme l ATP. Cette molécule est produite au cours de réactions chimiques comme la respiration cellulaire. Ainsi, les cellules, pour produire cette molécule essentielle pour les transferts à énergie dans les cellules, utilisent l énergie chimique de molécules qu elles prélèvent dans l environnement ou qu elles produisent par photosynthèse. Le glucose, en particulier, est un substrat énergétique métabolisable par toutes les cellules. Problème posé : Comment est transformée la matière organique? Compétences : Pratiquer une démarche scientifique. Mettre en œuvre un protocole en respectant rigoureusement les étapes. Respecter les règles de sécurité. Utiliser une chaîne ExAO (Latis-bio). Présenter les résultats pour les communiquer et les exploiter pour répondre au problème. Communiquer dans un langage scientifiquement approprié : schéma fonctionnel. Savoir la glycolyse, oxydation cytoplasmique du glucose et l ultrastructure d une mitochondrie. Ressources : - Documents. - Logiciel Rastop. - respiration cellulaire. Matériel : - Une suspension de levures «affamées» (qui ont perdu la quasi- totalité de leurs réserves glucidiques) et aérées. Un substrat métabolique : le glucose. - Des bandelettes glucotest. - Eau distillée, papier absorbant, éprouvette de 20 ml, seringue de 5 ml. ExAO : matériel informatique, sonde à 02, sonde à C02, bioréacteur, agitateur magnétique. Activité 1 : On veut comprendre le devenir du glucose en aérobiose. 1. Légendez les électronographies du document Etape 1 : concevoir une stratégie pour résoudre ce problème. 3. Etape 2 : mettre en œuvre le protocole de résolution proposé (document 2). 4. Etape 3 : présenter les résultats pour les communiquer. Reproduire le graphique obtenu avant et après addition de glucose et faire un tableau concernant les concentrations en glucose (voir correction). 5. Etape 4 : exploiter les résultats obtenus pour répondre au problème posé. 6. Une étude est aussi réalisée chez des cellules chlorophylliennes : A l aide du document 3, montrez que les cellules chlorophylliennes respirent également. Proposez une interprétation des mesures faites à la lumière et de celle réalisées à l obscurité. Activité 2 : La mitochondrie, un organite compartimenté et clé de la respiration cellulaire. 1. Légendez l électronographie avec l aide des mots soulignés (document 4). 2. La respiration cellulaire est un phénomène qui consiste en une oxydation d une molécule organique, ce qui libère de l énergie utilisable par la cellule et des déchets (CO2 et H2O). A partir de l analyse des documents 1 et 4, montrez que les mitochondries jouent un rôle important dans cette respiration. Vous préciserez ce rôle. 1

2 Activité 3 : la glycolyse, première étape de dégradation du glucose. 1. Suivre le protocole (document 5). Présentez les résultats et les interprétez. 2. Interprétez les expériences (document 6). 3. A l aide du logiciel Rastop, décrivez et comparez les molécules de glucose, d acide pyruvique et de CO2. Précisez le nombre d oxydation moyen du carbone dans chacune de ces deux molécules. 4. Faire un schéma simplifié représentant une mitochondrie dans le cytoplasme d une cellule eucaryote et représenter les relations mises en évidence entre le glucose, le pyruvate et le C02. 2

3 Document 1 : ultrastructure levure. Des levures (champignons unicellulaires) ayant séjourné dans des conditions aérobies ou dans des conditions anaérobies (sans dioxygène) pendant plusieurs jours n ont pas la même croissance (traité ultérieurement). Document 2 : protocole ExAO. On prépare une suspension de levures à 10g.L-1 que l on aère pendant une douzaine d heures avec un bulleur : ceci a pour but «d affamer» les levures qui auront consommé tous les substrats métaboliques. Les levures, à raison de 25 ml de suspension sont placées dans l enceinte réactive, les sondes plongeant dans le liquide. On procède à un réglage de l agitation de manière à ce que la sonde ne se trouve pas dans le cône de turbulence. Avant de lancer la mesure, on attend la stabilisation de la sonde. Au bout d une minute (temps nécessaire pour constater l évolution du taux de dioxygène en l absence de substrat, on introduit 2 ml de solution de glucose à 50 g.l-1, assez rapidement pour pouvoir visualiser l artefact correspondant à cette modification du milieu. 1. Paramétrer la mesure. La durée de la mesure est de 6 minutes. 2. Remplir l enceinte avec la quantité de suspension de levures (préalablement agitée) nécessaire. 3. Tester la présence de glucose à l aide d un glucotest. 4. Installer les sondes à O2 et C02 5. Fermer si nécessaire les autres orifices. 6. Lancer l agitation à vitesse modérée. 7. Préparer une seringue avec la solution de glucose. 8. Prévoir l insertion d un repère légendé sur le graphique précisant le moment de l injection. 9. Appeler le professeur pour l évaluation. 10. Lancer la mesure. 11. A t= 2 minutes, ajouter dans le réacteur de la solution de glucose et insérer un repère légendé sur le graphique. Calculer la concentration en glucose. 12. Poursuivre l enregistrement durant le temps restant. 13. Présenter les résultats de façon optimale en jouant sur les fonctionnalités du logiciel. 14. Tester la présence de glucose en fin d expérience. 3

4 Correction Document 3 : Les échanges gazeux entre les cellules chlorophylliennes et leur milieu. Document 4 : la mitochondrie, organite compartimenté site de la respiration cellulaire. On trouve des mitochondries dans presque toutes les cellules eucaryotes. Certaines cellules n en contiennent qu une seule, qui est grosse, mais la plupart en comportent des centaines, voire des milliers. Leur nombre dépend généralement de l activité métabolique de la cellule. Par exemple, les cellules mobiles ou contractiles ont proportionnellement plus de mitochondries par volume que les cellules moins actives. Lorsqu elles ont été projetées en accéléré, des prises de vue image par image de cellules vivantes ont révélé que les mitochondries se déplacent, modifient leur forme et se divisent en 2 (exemple : vidéo mitochondries marquées par protéine GFP se déplaçant dans les neurones). L enveloppe qui entoure une mitochondrie est formée de deux membranes : celles-ci se composent d une double couche de phospholipides, dans laquelle s enchâsse un assemblage unique de protéines. La membrane externe est lisse et perméable à de nombreuses substances permettant des échanges avec le cytosol, alors que la membrane interne est repliée sur elle-même et dessine des crêtes dont la forme varie selon le type de cellules. La membrane interne divise la mitochondrie en deux compartiments : un espace intermembranaire (env 10 nm), situé entre la membrane interne et la membrane externe, et une matrice mitochondriale, située dans l espace délimité par la membrane interne. Grâce à leur surface très plissée, les crêtes augmentent jusqu à cinq fois l aire de la membrane interne, soit l aire de la respiration cellulaire. Les mitochondries mesurent de 1 à 10 µm de long environ : Membrane interne 4

5 Membrane externe 40% de lipides et 60% de protéines (composition voisine de celle de la membrane cellulaire) Membrane interne Composition très différente de la membrane externe (beaucoup plus riche en protéines) Présence de nombreuses enzymes dont l ATP synthase dont la tête est orientée vers la matrice. Matrice Absence de glucose Présence de pyruvate et d ATP Présence de nombreuses enzymes dont des déshydrogénases et des décarboxylases. Présence d ADN (molécules d ADN circulaires comme chez les bactéries et attachées à la membrane interne) et de ribosomes mitochondriaux. Les constituants des différents éléments d une mitochondrie Document 5 : protocole mise en évidence de la glycolyse. 1. Préparer 4 tubes à essais contenant chacun 10 ml d eau distillée. 2. Découper des cubes de navet de 2 mm de côté et en déposer rapidement 10 dans chaque tube à essais. La découpe permet de libérer dans l eau des molécules cytoplasmiques solubles. 3. Plonger les tubes 3 et 4 dans l eau bouillante pour dénaturer les protéines. 4. Ajouter du glucose dans les tubes 2 et Filtrer puis ajouter dans chaque tube du bleu de méthylène pour obtenir une coloration bleu très pâle. Le Document 6 : bleu de méthylène est un indicateur d oxydoréduction : à l état oxydé il est bleu, tandis qu à l état réduit il est incolore. A Expériences : des levures sont cultivées sur un milieu très oxygéné et contenant une très faible quantité de glucose radioactif marqué au carbone 14. Des prélèvements de levures réalisés au temps T0, T1, T2 permettent de suivre le devenir du carbone 14 dans la cellule. Voici les résultats ci-dessous : Temps Milieu extérieur cytosol Matrice mitochondriale TO +++ T T T T4 ++ Evolution de la radioactivité dans la cellule et dans le milieu extérieur Radioactivité faible + ; moyenne ++, forte +++ Temps Milieu extérieur cytosol Matrice mitochondriale TO glucose T1 glucose glucose T2 pyruvate pyruvate T3 CO2 pyruvate T4 CO2 Noms des molécules contenant du 14C dans la cellule et dans le milieu extérieur au cours du temps 5

6 B Histoire des Sciences. La glycolyse est une voie cytoplasmique d oxydation du glucose commune à la respiration et à la fermentation. Elle a été élucidée après plus de 40 ans de recherches. Le chimiste Eduard Buchner, qui étudiait la fermentation, constata que «la complexité de la levure n est pas indispensable à ce processus». Il émit l hypothèse que «le ferment actif n est qu une substance dissoute, sans doute une protéine» qu il baptisa la «zymase». La «zymase» s est révélée être un mélange de protéines ayant une activité catalytique, ou enzymes. Il fut montré en 1905 que les extraits acellulaires permettant la glycolyse doivent également contenir du phosphate inorganique, de l ATP, de l ADP et un oxydant R. Otto Meyerhof contribua finalement à élucider les 9 étapes de la glycolyse. L oxydation d une molécule de glucose lors de la glycolyse produit 2 molécules d acide pyruvique. Elle est couplée à la réduction de 2 composés R en R H2 (chimiquement proches de R et RH2 qui interviennent dans la photosynthèse) et à la phosphorylation de 2 molécules d ADP. C L organite de la respiration. Pour vérifier si les mitochondries ont un rôle dans la respiration, on réalise des cultures de souches sauvages (normales) ou de souches mutées présentant des mitochondries non fonctionnelles. On injecte du glucose dans le milieu dans chaque cas dès 50 secondes. Consommation de dioxygène par des levures possédant des mitochondries normales ou déficientes. La mise en évidence expérimentale du rôle des mitochondries. 6