PRINCIPALES TECHNIQUES UTILISEES EN GENOMIQUE

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1 PRINCIPALES TECHNIQUES UTILISEES EN GENOMIQUE

2 Définitions généralités Quelques chiffres 46 chromosomes 22 paires d autosomes (n=44) 1 paire de gonosomes (n=2) : XX/F et XY/H 300 bandes cytogénétiques = 10 Mb 3 milliards de paires de bases = Mb 2 brins d ADN complémentaires 4 bases différentes Pyrimidine : Adénine et Thymine Purine : Guanine et Cytosine

3 Définitions généralités Gène gènes gène Promoteur Site de départ de la transcription Site de fin de la transcription Régions régulatrices Séquences 5 régulatrices TATA box Codon initiation de la traduction ATG Codon STOP Exon 1 Intron A Exon 2 Intron B Exon 3 3 Séquence de tête non traduite Séquence de queue non traduite

4 Définitions généralités Oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs (Proto)oncogènes Gène dont le gain de fonction favorise l oncogène Anti-oncogènes ou gène suppresseur de tumeur Gène dont la perte de fonction favorise l oncogénèse

5 Définitions généralités Code génétique

6 Définitions généralités Anomalies génomiques Quantitative ou de nombre Qualitative ou de structure Tout le génome : aneuploïdie Insertion Un chromosome Inversion Perte : monosomie Gain : polysomie Un gène ou une région génomique Mutation Translocation équilibrée Délétion, perte d une copie (hétérozygote) ou des 2 copies (homozygote) Gain, duplication, amplification Mixte qualitative et quantitative : translocation déséquilibrée

7 Les principales techniques Focale FISH Etude des marqueurs microsatellites Séquençage QPCR Pangénomique Caryotype Caryotype 24 couleurs CGH classique CGH sur puce ou CGH array

8 PCR ou Polymerase Chain Reaction

9 Caryotype principe Blocage et visualisation des chromosomes en métaphase

10 Caryotype technique : application neuro-oncologie Cinq sous types de gliomes (n=40) Gliomes à caryotype normal Gliomes avec anomalies des gonosomes Gliomes pseudodiploïdes avec trisomie du chr 7 Gliomes pseudodiploïdes avec réarrangements chrs complexes Gliomes hypertriploïde/hypotétraploïde Hecht et al., 1995a ; Hecht et al., 1995b

11 Caryotype : avantages et inconvénients Avantages Inconvénients Détection des anomalies de structures Détection des aneuploïdies Détection pangénomique Peu cher Lourde difficile à maitriser Difficile à interpréter Nécessite une expertise cytogénétique Nécessite une mise en culture courte de la tumeur Certains gliomes (LGG) ne survivent pas Peu résolutif : 10 Mb

12 Caryotype 24 couleurs : principe Blocage et visualisation des chromosomes en métaphase Marquage des chromosomes par des sondes spécifiques

13 Caryotype 24 couleurs : application neuro-oncologie Lignée cellulaire de gliomes Hypotétraploïde Translocation t(x;17) Cowell et al., 2004

14 Caryotype 24 couleurs : avantages et inconvénients Avantages Inconvénients Détection des anomalies de structures Nécessite une mise en culture courte de la tumeur Détection des aneuploïdies Détection pangénomique Facilite l analyse cytogénétique Onéreux Certains gliomes (LGG) ne survivent pas Difficile à maitriser Nécessite une expertise cytogénétique Peu résolutif : 10 Mb

15 CGH classique ou sur chromosomes métaphasiques ADN Blocage tumoral* et FITC visualisation * ADN normal* des chromosomes Rhodamine * en métaphase Chromosomes métaphasiques normaux Microscope à fluorescence

16 CGH classique ou sur chromosome métaphasique Gain Perte

17 CGH classique ou sur chromosome métaphasique 30 astrocytomes de grade II Hirose et al., 2003

18 CGH classique ou sur chromosome métaphasique Avantages Inconvénients Détection pangénomique Lourd Onéreux Nécessite des métaphases de bonne qualité Difficile à maitriser Nécessite une expertise cytogénétique Peu résolutif : 10 Mb Pas de détection des anomalies de structures Pas de détection des aneuploïdies

19 CGH sur puce à ADN ADN normal* Cy3 * ADN tumoral* Cy5 * ADN de BAC/PAC normaux Scanner

20 CGH sur puce à ADN Gain Perte Ratio des fluorescences Cy5/ Cy3

21 chromosomes Techniques de biologie moléculaire CGH sur puce à ADN Ratio de fluorescence Cy5/Cy3 (Tumoral/Normal) Récepteur du facteur de croissance EGF

22 CGH sur puce à ADN Type A Type B Type C Chr 1p perdu N=112 Sex ratio / = 1,6 Chromosome p/19q Chr 19q perdu EGFR amplifié Chr 10 perdu Chr 7 gagné Chr 9 perdu Chr 10 perdu Amplification Gain Normal Délétion 22

23 CGH classique ou sur chromosome métaphasique Avantages Inconvénients Détection des anomalies quantitatives Pas de détection des anomalies de structures Détection pangénomique Résolution = 1Mb S affranchit des étalements chromosomiques Pas de détection des aneuploïdies Onéreuse Ne nécessite pas d expertise cytogénétique

24 Etude des marqueurs microsatellites Séquence répétées = 40% du génome humain Séquences répétées dispersées (copies dispersées) SINEs = Short Interspread Repeated Sequences LINEs = Long Interspread Repeated Sequences Séquences répétées en tandem (copies adjacentes) Longueur Motif Localisation Synonyme Satellites 100 kb-1 Mb > 100pb centromères Minisatellites 1-30kb pb télomères VNTR Microsatellites <150 pb 1-10pb le long du génome STR 5 Séquences régulatrices TATA box Exon 1 Intron A Exon 2 Intron B Exon 3 3

25 Etude des marqueurs microsatellites Cairncross et al., 1998

26 Etude des marqueurs microsatellite Avantages Inconvénients Peu onéreuse Analyse focale Précis Nécessite le sang du patient

27 Hybridation fluorescente in situ FISH Visualisation une région génomique grâce à une sonde fluorescente

28 Hybridation fluorescente in situ FISH Smith et al., 2000; Jenkins 2006

29 Hybridation fluorescente in situ FISH Avantages Inconvénients Analyse de structure Analyse focale Visualisation directe Technique délicate Nécessite des étalements chromosomiques dans le meilleur des cas

30 PCR quantitative ou en temps réel génomique

31 PCR quantitative ou en temps réel génomique Gène de référence EGFR Seuil Smith et al., 2000; Jenkins 2006

32 PCR quantitative ou en temps réel génomique Avantages Inconvénients Précise Analyse focale Quantitative Technique robuste

33 Séquençage

34 Séquençage Balakrishnan et al., 2007

35 Séquençage Avantages Inconvénients Précis Analyse focale Recherche de mutation ponctuelle Onéreuse

36 Comment détecter la codélétion des chr 1p/19q Technique Remarques LOH oui Mais utiliser plusieurs marqueurs sur les 2 bras chromosomiques et nécessite le sang du patient CGHc oui Lourde CGHa oui Onéreuse FISH oui Difficulté d avoir des lignées de courtes durées pour les étalements chromosomiques Mais utiliser plusieurs marqueurs sur les 2 bras chromosomiques Séquençage non Inadaptée PCRQ oui Mais utiliser plusieurs marqueurs sur les 2 bras chromosomiques

37 Conclusions Techniques complémentaires Quantité Qualité Choisir Question Pangénomique Focale Matériel Congelé Paraffine Sang Coût