Introduction à la Protéomique

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Céline Hébert
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1 Introduction à la Protéomique Joël Rossier DiagnoSwiss 30 mars 2001

2 Que est-ce que la Protéomique? Définition But Problèmes spécifiques Moyens techniques Etat de l art Perspectives

3 Qu est-ce que la Protéomique «L a protéomique est une science qui vise à connaître la présence de protéines dans les différentes cellules biologiques à un certain moment!» Système dynamique Génomique

4 Buts de la protéomique Comprendre et contrôler l expression des gènes (génomique( fonctionnelle) Problème de corrélation entre les gènes et les protéines trouvées: gènes humains protéines Trouver des couples maladie-protéines Marqueurs de maladie Protéines cibles }! Modification post translationnelle

5 Outils analytiques utilisés Séparation 2-D Gel Chromatographie liquide (phase inverse) Détection Révélation sur gel (Argent, comassie blue) Immunoblotting Spectrométrie de masse ESI Maldi

6 Préparation de l échantillon Plasma humain : An aliquot of 6.25 µl of human plasma was mixed with 10 µl of a solution containing SDS (10% w/v) and DTE (2.3% w/v). The sample was heated to 95o C for 5 minutes and then diluted to 500 µl with a solution containing urea (8 M), CHAPS (4% w/v), Tris (40 mm), DTE (65 mm) and a trace of bromophenol blue. Sixty µl (45 µg) of the final diluted plasma sample was loaded onthe first dimensional separation Extrait d E.coli coli ECOLI (Escherichia coli): Cells were grown aerobically in glucose minimal morpholinopropane sulfonate (MOPS), plus thiamine at 37oC. Growth was stopped in the late exponential phase at an OD of 1 at 600 nm. Five hundred ml of culture medium was centrifuged for 30 min at 3000 rpm at 4\xa1 C and the pellet was washed 4 times for 10 min at 4000 rpm in 10 ml low salt washing sample buffer: KCl 3.0 mm, KH2PO4 1.5 mm, NaCl 68 mm, NaH2PO4 9.0 mm. The pellet was then resuspended in 600 µl of a buffer containing 10 mm Tris-HCl ph 8.0, 1.5 mm MgCl2, 10 mm KCl, 0.5 mm DTE, 0.5 mm Pefabloc SC (protease inhibitor), 0.1% SDS, and stored at -20o C. One µl of the latter was mixed with 60 µl of a solution containing Urea (8 M), CHAPS (4 % w/v), Tris (40 mm), DTE (65 mm) and a trace of bromophenol blue. After centrifugation at g for 5 minutes, the whole final diluted E. coli sample was loaded onto the IPG gel strip.

Electrophorèse bidimensionnelle 2-D = séparation par taille (SDS-PAGE) 4 5 6 7 ph 1-D = Focalisation

7 Electrophorèse bidimensionnelle 2-D = séparation par taille (SDS-PAGE) ph 1-D = Focalisation isoelectrique gradient de ph de 4 à 7 Extrait cellulaire d E-coli ch/ch2d/protocols/

8 1-D Focalisation Isoelectrique (IEF) Faire migrer les protéines dans un gradient de ph. Les protéines s arrêtent là ou le ph = pi

9 2-D Séparation par Taille Après dénaturation avec du SDS les protéines deviennent chargées négativement. On fait les fait migrer dans un gel pour les séparer par taille

10 Détection directe sur le gel (1) Révélation à l argent AgNO 3 + protéine Ag Détection par scanner à densité optique Digitalisation de l image Avantage: sensible, rapide Désavantage: pas MS compatible Non spécifique

11 Détection directe sur le gel (2) Révélation au bleu de commassie Interactions hydrophobes Désavantage: moins sensible Avantage: MS compatible Non spécifique

12 Transfert sur membrane PVDF Electroblotting du gel à la membrane Immunoblotting Anticorps marqué avec une enzyme Détection par chimie luminescence Spécifique: sensible, permet de visualiser differentes isoformes

Détection de L EPO recombinante Recombinant erythropoietin in urine Françoise Lasne; Jacques de Ceaurriz; Nature Volume 405 Number 6787 Page 635

13 Détection de L EPO recombinante Recombinant erythropoietin in urine Françoise Lasne; Jacques de Ceaurriz; Nature Volume 405 Number 6787 Page 635 (2000) A) Endogene B) Recombinant EPO ß C) Recombinant EPO α D) Patient type E) Patient traité F) Patient traité G) Cycliste du TDF 98 F) Cycliste du TDF 98

14 Analyse comparative du gel Outils bioinformatiques (Melanie,, Lynx) Base de donnée expasy.ch

15 2-D gel séparation Méthode de choix car Séparation de 5000 protéines d un seul échantillon Base de donnée connue mais Difficilement quantitative Reproducibilité? Relative lenteur

16 Séquençage de protéine Extraire la protéine du gel (laver, couper dissoudre le gel) Digérer la protéine avec des enzymes (trypsine) Séparer les peptides (chromatography( phase inverse) Analyser en MS/MS

17 Analyse MS Méthode de Ionisation: Electrospray HV Maldi TOF Laser capillaire + MS/MS MS temps de vol

18 Electrospray MS Spectrométrie de masse de première dimension Mass/charge de la protéine ou du peptide Cytochrome C dans 50:49:1 Eau/MeOH, Acide Acétique

19 LC Electrospray MS/MS Analyse de peptide digéré par la trypsine Utilisation de la MS/MS pour identifier la séquence d acide aminé

Nouvelles approches Seldi de Cipergen (www.ciphergen.

20 Nouvelles approches Seldi de Cipergen ( Faire des réseaux de surface avec différentes activités: désorption

21 Scanner moléculaire 2-D gel, transfert sur PVDF, desorption laser Hochstrasser, Genève

22 Nouvelle approche Off-Gel Electrophoresis: Séparer les protéines par leur pi Les laisser en solution Analyse LC-MS/MS Analyse Maldi TOF Immunoassay

23 Purification par Off-Gel IEF Les protéines sont purifiées selon leur point isoélectrique et sont ensuite disponible en solution pour des analyses (Séquençage, Immunoassay, reaction enzymatique, etc) Arbitrary Units A B C D E E F 30 E F Time /min

24 Conclusion La protéomique est une science en plein développement Essentielle pour la compréhension du vivant Très dépendante des techniques analytiques, qui sont en cours de développement

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