Bases moléculaires de la multirésistante et de l identification
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- Gisèle Langevin
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1 Bases moléculaires de la multirésistante et de l identification
2 Transcription et traduction dans la cellule La cellule (du latin cellula petite chambre) est l'unité structurale, fonctionnelle et reproductrice constituant toute partie d'un être vivant ADN Transcription en ARNm REPLICATION DNA DNA TRANSCRIPTION ARMm mature ARNm noyaux ADN ARN ARNt TRADUCTION ARNm séquence nucléotidique de l ARNm séquence d acides aminés de la protéine Membrane cellulaire
3 Activitité des antibiotiques Empêcher la multiplication Destruction REPLICATION DNA DNA TRANSCRIPTION ADN ARN TRADUCTION séquence nucléotidique de l ARNm séquence d acides aminés de la protéine Membrane cellulaire
4 Activitité des antibiotiques
5 Principe de la résistance Pas de plasmides La cellule mycobactérie né est entourée d une paroi cellulaire spécialisée fortement hydrophobe, ce qui réduit sa perméabilité à de nombreux agents antimicrobiens Mutation génétique naturelle amplifiée par la pression de sélection de médicament
6 Mutation Réplication de l ADN Type sauvage Réplication de l ADN Séquence mutante ADN parental Type sauvage Type sauvage Descendance, 1 er génération Descendance, 2 ème génération Type sauvage
7 mutations Les mutations (altérations) de la séquence de l ADN modifient la séquence des acides aminés Une modification de la séquence des acides aminés modifie la structure de la protéine Une modification structurelle de la protéine modifie la fonction de cette dernière
8 Mode d action des antituberculeux Rifampicine Isoniazide Pyrazinamide Ethambutol Mode d action inhibe l ARN polymérase par fixation à sa sous unité β Inhibe la synthèse des acides mycoliques de la paroi Intervient sur la synthèse des AG à chaînes courtes (complexe Fas1) Inhibe la synthèse des acides mycoliques de la paroi par fixation à l arabinosyl transférase - Mutations - %age de R lié à ces mutations - Gène rpob - > 96 % -Gènes katg, inha, ahpc, % - Gène pnca - 72 à 97 % -Gène embb - 47 à 65 %
9 Mode d action des antituberculeux Glycopeptides et protéines libres de la paroi cellulaire Acides mycoliques INH PZA Porine Précurseurs d acides gras à chaîne courte ADN chromosomique Lipoarabinomannane (LAM) Free Wall Gly colipids and Proteins My colic Acids Arabinogalactan Short chain f atty acid precursors ARN polymerase sous-uinté β Chromosomal DNA Paroi cellulaire et membrane cytoplasmique Cytoplasmique Porin Lipoarabinomannan (LAM) RNA Polymeras e (ß-s ubunit) Cell Wall and cytoplasmic membrane Cytoplasm RMP Transcription en ARN RNA Transcription
10 Résistance à la rifampicine bloque la transcription par la liaison à la sous-unité β de l'arnpolymérase dépendante de l ADN bactérienne La RMP présente un effet bactéricide précoce contre les M. tuberculosis métaboliquement actifs et une excellente action stérilisante tardive contre les courtes bouffées d activité métabolique des micro-organismes en état de semi-dormance Alors que la mono-résistance à l INH est courante, la mono-résistance à la RMP est rare La résistance à la RMP apparaît le plus souvent dans des souches qui sont déjà résistantes à l INH, de sorte que la résistance à la RMP peut être utilisée comme marqueur de multirésistance de remplacement
11 Résistance à la Rifampicine : mutation du gène rpob Mutations de la région (sous unité β) Leu Gln Asp Ser His Ser Leu Pro Leu Tyr Leu Tyr Leu Pro Pro Val Asp Trp Arg Leu 90 % des mutations de R = 10 % 35 % 45 %
12 Résistance à la rifampin et rpob La résistance à la RMP est due à des mutations qui se produisent dans une région centrale bien définie de 81 paires de bases (27 codons) du gène qui code pour la sousunité β de l ARN-polymérase (rpob) Plus de 96 % des souches résistantes à la rifampicine contiennent une mutation dans cette région de 81 bp de rpob Les mutations les plus courantes (65 à 86 %) altèrent le codon 526 ou le codon 531 et se traduisent par une résistance de degré élevé à la RMP L altération d autres codons provoque l apparition d une résistance de faible degré De rares mutations associées à une résistance à la rifampicine ont également été observées dans la région amino-terminale de rpob
13 Résistance à l isoniazide et inha L INH bloque la synthèse des acides mycoliques de la paroi cellulaire, principal composants de l enveloppe de M. tuberculosis. L une des cibles intracellulaires du médicament est l énoyl-acp réductase des acides gras (InhA) (Basso et coll., 1998). Cette enzyme participe à la synthèse des acides mycoliques Des mutations dans la région du promoteur du gène inha qui code pour cette enzyme provoquent la surexpression de la protéine La surexpression de l enzyme peut contrecarrer l effet de l INH et provoquer une résistance de faible niveau au médicament
14 Résistance à l isoniazide et katg L isoniazide (INH) est un pro-médicament qui doit être activé dans les espèces mycobactériennes qui y sont sensibles L activation de l INH produit un certain nombre de composés fortement réactifs capables de léser la paroi des cellules mycobactériennes Les isolats cliniques résistants à l INH ont souvent perdu leur activité catalase-peroxydase (Middlebrook et coll., 1954) L association entre cette enzyme et l activation de l INH a été démontrée quand le gène de la catalase-peroxydase mycobactérienne (katg) a été cloné et séquencé (Zhang et coll., 1992) Des mutations de ce gène ont été observées dans 70 à 80 % des isolats cliniques hautement résistants à l INH La mutation Ser315Thr est celle qui est la plus couramment observée
15 Méthodes génotypiques Tous les gènes ne sont pas de bonnes cibles Antituberculeux %age de souches R avec mutation connue Nombre de gènes impliqués Difficulté des méthodes phénotypiques Meilleures cibles par ordre de priorité Rifampicine Isoniazide Pyrazinamide Ethambutol /- Streptomycine Kana / amikacine 50? 1 +/- Fluoroquinolones
16 Méthodes génotypiques amplification génique (PCR) Hybridation avec des sondes oligonucléotidiques Séquençage
17 Détection moléculaire rapide de la résistance à l INH et à la RMP: méthode «Line-Probe Assay» (test par sondes alignées) 1. ADN isolé de l échantillon d origine traité ou d une culture de cellules bactériennes 2. Amplification en chaîne par polymérase (PCR) de l ADN mycobactérien à l aide d amorces marquées par la biotine 3. Dénaturation en simples brins de l ADN amplifié 4. Hybridation de l ADN dénaturé à des sondes alignées sur une bandelette 5. Détection à l aide d enzymes des bandes dans lesquelles des produits d ADN se sont liés à la bandelette
18 Bandelette MTBDRplus pour l identification du complexe de bacilles tuberculeux et de la résistance à la RMP et/ou à l INH Témoin conjugué (CC) Témoin d amplification (AC) Complexe de M. tuberculosis (TUB)
19 Identification Une espèce: caractères commun gène Un gène est une région d ADN qui est transcrite pour coder une protéine
20 Gènes conservés: Identification interespèces Gène variables hsp65 code pour la HSP de 65kDa rpob Espace intergénique ITS 16s-23S
21 Digestion enzymatique BSTEII HaeIII
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