Haima = sang Stasis = arrêt. D.Silve TD N 3

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1 L HEMOSTASE Haima = sang Stasis = arrêt D.Silve TD N 3

2 Chronologie de l hémostase L Hémostase: 3 étapes inter-dépendantes qui se déroulent de façon concomitante - Hémostase primaire: aboutit formation d un agrégat plaquettaire («thrombus blanc»), permet seul l arrêt des saignements dans les capillaires les plus fins - Coagulation plasmatique: aboutit par la formation d un réseau de fibrine, à la consolidation de l agrégat plaquettaire - Fibrinolyse: permet la lyse du caillot fibrino-érythroplaquettaire, et le maintien de la perméabilité vasculaire, une fois la cicatrisation du vaisseau achevée

3 De zéro à.48(72)h

4 L Hémostase: processus localisé et rapide, en équilibre physiologique entre processus coagulant et fibrinolyse, régulés eux-même par des inhibiteurs et des activateurs Régulation de l hémostase Plaquettes + Facteurs de la Coagulation Activateurs du plasminogène Hémostase primaire Coagulation plasmatique Fibrinolyse Inhibiteurs physiologiques de la coagulation Inhibiteurs physiologiques de la fibrinolyse Ce processus nécessite la coopération entre: -la paroi des vaisseaux sanguins -les protéines plasmatiques, facteurs de la coagulation et de la fibrinolyse -les cellules sanguines, en particulier les plaquettes

5 L HEMOSTASE PRIMAIRE Temps Endothélio-Plaquettaire LA COAGULATION Temps Plasmatique Passage du sang de l état liquide à l état gélifié, résultant de la transformation d une protéine soluble,le Fibrinogène,en une protéine insoluble, la Fibrine. Ce changement d état correspond à une cascade d activations de type enzymatique. L enchaînement réactionnel implique un grand nombre de facteurs de nature protéique présents,pour la plupart à l état de proenzyme. Interviennent également le calcium ionisé et les phospholipides sous forme du Facteur 3 plaquettaire et de Thromboplastine tissulaire dont le rôle est de fixer les facteurs activés(site,concentration) -formation de Thromboplastine active=prothrombinase THROMBINOFORMATION FIBRINOFORMATION

6 LA FIBRINOLYSE Elle correspond à la dégradation de la Fibrine sous l effet d une enzyme spécifique:la PLASMINE Celle ci résulte de l activation du Plasminogène,le processus d activation empruntant,la aussi, les deux voies. La Plasmine,enzyme protéolytique,attaque le Fibrinogène et la Fibrine et donne naissance aux: PDF(fibrinogène)et D dimères(fibrine)

7 LE BILAN DE COAGULATION Pour le biologiste,ce bilan doit reposer sur des tests explorant les grandes étapes de la coagulation: l hémostase primaire: temps de saignement(ts) numération des plaquettes La voie endogène: temps de céphaline activée(tca) Épreuve «globale» La voie exogène: temps de quick-taux de prothrombine(tc-tp) Épreuve «semi-globale» La fibrinoformation: dosage du fibrinogène Épreuve analytique

8 Surveillance biologique d un traitement anticoagulant Afin de prévenir ou de limiter l extension d une thrombose, le geste thérapeutique consiste à instaurer un ttt anticoagulant faisant appel à l héparine ou aux antivitamines K. Héparine et AVK sont des inhibiteurs thérapeutiques La surveillance biologique de ce ttt est indispensable pour l ajustement de la posologie nécessaire et suffisante. Héparine TCA et héparinémie AVK TP + INR

9 Etape préanalytique: le prélèvement Plvt sur anticoagulant: citrate trisodique Rapport anticoagulant-sang total=1 pour 9 (vol à vol) Ponction franche délais avant tests:2 à 4heures maxi Obtention d un PPP

10 Quand explorer la coagulation? Manifestations cliniques hémorragiques Incident hémorragique per- ou post-opératoireopératoire Bilan pré-opératoire Thromboses Surveillance traitement anticoagulant

11 Voie endogène Facteurs Contacts PK, KHPM, XIIa, XIa, IXa Schéma simplifié de la coagulation Voie exogène Facteur Tissulaire VIIa PL Ca2+ VIIIa PL Ca2+ X II Xa PL Ca2+ Va IIa Fibrinogène Fibrine

12 Mesure du Temps de Céphaline + Activateur (TCA): Facteurs Contacts PK, KHPM, XIIa, XIa, IXa PL Ca2+ VIIIa Exploration de Fonctionnalité Voie endogène X II Xa Réactifs: Activateurs «Contacts»: Kaolin, Silice, Célite, Acide éllagique Substitut PL: Céphaline PL Ca2+ Va IIa CaCl 2 Plasma Fibrinogène Fibrine

13 Mesure du Temps de Céphaline + activateur Temps de formation d un caillot de fibrine d un plasma déplaquetté, décalcifié, en présence d activateur des facteurs «contacts», de PL et de Ca2+ Activateur 100µl Plasma 100µl N: sec Préchauffage 3 min 37 c CaCl 2 préchauffé à 37 C 100µl Déclenchement Chronomètre Stop Chrono Caillot Fibrine Résultat exprimé en secondes par rapport à un plasma Témoin normal TCA Patient TCA allongé si ratio > 1,2 TCA Témoin TCA

14 Épreuve de correction de l allongement isolé du TCA Activateurs 100µl CaCl 2 préchauffé à 37 C 100µl Plasma Témoin N 100µl Préchauffage 3 Déclenchement Plasma min 37 c Chronomètre Patient Caillot 100µl Fibrine Calcul Indice de Rosner Stop Chrono TCA (TCA Mélange TCA Témoin N) TCA Patient x100 Indice <12 : TCA Patient corrigé par Témoin: Déficits Facteurs Indice >15: TCA Patient non corrigé par Témoin: Ac AntiCoagulants Circulants

15 Détection de la formation du caillot de Fibrine «Lectures oculaires» Barreau aimanté en rotation Technique du crochet accrochage caillot/filament gélatineux Bain-marie électromagnétique arrêt de rotation du barreau

16 «Lecture électromagnétique» sur semi (ST4)- ou automates complets Bille aimantée Micro-cuvette cuvette immobile Bobine électromagnétique Bobine électromagnétique Oscillation pendulaire de la bille ralentissement puis arrêt mouvement pendulaire par caillot fibrine Bille aimantée Micro-cuvette cuvette en rotation «Ergot central» Aimant Immobilité de la bille par aimantation emprisonnement dans caillot de fibrine provoque mise en rotation associée à la micro- cuvette

17 «Lecture optique» par turbidimétrie à 650 nm: moins utilisée - DO départ: turbidité plasma (+réactifs) -variation DO: addition réactif déclenchant -variation DO: formation caillot fibrine

18 -Sur semi- ou automates complets, Déclenchement chrono simultané à addition réactif «déclenchant» (Thromboplastine pour TQ, CaCl2 pour TCA) par pipette reliée électriquement Arrêt Chrono automatique par détection caillot fibrine: - arrêt mouvement pendulaire bille (diminution intensité champ magnétique) - mise en rotation bille (coupure champ magnétique) - changement de turbidité -Sur semi-automates, Addition manuelle: plasma, réactif, réactif «déclenchant» -Sur automates complets, Travail sur Tube primaire Sang centrifugé (Anticoagulant Citrate de Na+ 3,8%), tous les additions de réactifs sont automatisées

19 Mesure du Temps de Quick (TQ) ou Taux de Prothrombine (TP): Exploration de Fonctionnalité Voie exogène Réactifs: Thromboplastine tissulaire = Facteur Tissulaire + PL CaCl 2 Plasma X II Xa PL Ca2+ Va Facteur Tissulaire VIIa PL Ca2+ IIa Fibrinogène Fibrine

20 Mesure du Temps de Quick Temps de formation d un caillot de fibrine d un plasma déplaquetté, décalcifié, en présence de FT, PL et Ca2+ Thromboplastine tissulaire calcique préchauffée à 37 C 200µl Stop Chrono Plasma 100µl Préchauffage 2 min 37 c Déclenchement Chronomètre Caillot Fibrine TQ N = sec Expression TQ en pourcentage Taux de Prothrombine (TP): besoin étalonnage Droite de Thivolle

21 Etalonnage: Mesure TQ sur Plasmas calibrés TP 100%, 50%, 33%,. Droite de Thivolle TQ sec TP Pathologique si < 70% = TQ allongé %TP Expression TQ en INR (International Normalized Ratio) : réservé aux surveillances de patients traités aux AntiVitamines K INR=( TQ Patient TQ Témoin ) ISI ISI: Indice de Sensibilité Internationale de la thromboplastine

22 Allongement isolé TQ: Déficit VII Effet Inhibiteur : -thérapeutique: (présence héparine, en principe pas d allongement sauf si [Héparine] importante), début traitement Anti-Vitamine K -pathologique: ( (Anticoagulants circulants) Allongement isolé TCA: Déficit XII, XI, IX, VIII Effet Inhibiteur: Ac anti-facteurs / Ac anti-phospholipides -thérapeutique: héparine, et AVK -pathologique: Ac anti-facteurs, Ac anti-phospholipides

23 Allongements associés TQ et TCA: Déficit facteur voie commune: X, V, II, I Dysfibrinogénémie Dysfibrinogénémie. Effets inhibiteurs: Ac anti-facteurs, Ac anti-phospholipides, Inhibiteurs polymérisation (PDF, anti-polymérase) Inhibiteurs thérapeutiques: héparine, AVK

24 Dosage chronométrique du Fibrinogène -dosage indirect, car mesure d un temps d apparition de fibrine par transformation de la totalité du fibrinogène présent -temps de coagulation à 37 C d un plasma dilué, citraté, déplaquetté, en présence de thrombine concentrée, est inversement proportionnel à la quantité de fibrinogène -dosage quantitatif et qualitatif -besoin étalonnage Temps de coagulation en sec. Thrombine calcique préchauffée à 37 C 200µl Plasma 200µl Préchauffage 2 min 37 c Déclenchement Chronomètre Stop Chrono Caillot Fibrine Temps de coagulation N : 2 à 4 g/l 1,5 3 6 Fibrinogène g/l

25 Dosage chronométrique isolé de facteur de la coagulation -Plasmas réactifs déficients en un seul facteur -Temps de coagulation d un plasma déficitaire est fonction de la quantité du facteur apporté par le plasma à tester -Résultats exprimés en % de facteur par rapport à des plasmas normaux étalons

26 Facteur Nom I II III IV V VII VIII IX X XI XII XIII Fibrinogène Prothrombine Facteur tissulaire ou thromboplastine tissulaire Calcium Proaccélérine (Facteur labile) Proconvertine (Facteur stable) Facteur Antihémophilique A, Globuline antihémophilique Facteur Antihémophilique B, composant de la thromboplastine plasmatique, Facteur Christmas. Facteur Stuart-Prower Antécédent de la thromboplastine plasmatique, Hémophilie C, Facteur Rosenthal. Facteur Hageman. Facteur stabilisant la fibrine. Facteur Laki-Lorand.