Intérêt de la fluorescence. La finesse

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1 Intérêt de la fluorescence La finesse

2 R R V B lumière blanche chromophore V B En fond clair: le contraste est du à l absorption des photons par les chromophores excitation λ1 bleu λ2 > λ1 émission λ2 vert En fluorescence: le contraste est du à l émission d un photon de plus grande longueur d onde

3 Substance fluorescente Énergie électron electron Photon émis (vert) electron electron Photon excitateur (bleu)

4 Filtre excitateur Filtre d arrêt Lentilles microscope λ1 λ2 Faisceau incident objet Faisceau émis

5 Epifluorescence oculaire Source de lumière miroir dichroïque Objectif échantillon

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9 Différents fluorochromes Fluorochrome longueur d onde longueur d onde excitation émission FITC rhodamine bleu DAPI

10 PRINCIPE MICROSCOPIE CONFOCALE SCHEMA GENERAL La lumière d'excitation émise par le laser passe par un "pinhole" d'excitation qui réduit la source à un point lumineux. Le faisceau est ensuite filtré (filtre d'excitation) de manière à sélectionner la ou les raies d'excitation utiles ainsi que leurs intensités respectives. Il est ensuite réfléchi sur un miroir dichroïque qui réfléchit sélectivement la lumière d'excitation et est transparent pour la lumière émise par les fluorochromes. La lumière d'excitation est alors focalisée en un point de la préparation via l'objectif du microscope (flèches bleues). Ce dernier capte alors la lumière émise par les fluorochromes excités. Celle émise par le point situé sur le plan focal de l'objectif est focalisée via l'objectif sur le capteur CCD (photomultiplicateurs) qui transforme le signal lumineux en signal électrique (flèches rouges montantes), après passage à travers un bloc de filtrage. Par contre celle émise par des fluorochromes situés au-dessus et audessous du plan focal est filtrée à l'entrée du détecteur par la présence d'un "pinhole de sortie" (flèche noire montante). Le capteur CCD enregistre le signal sous forme de charges/pixel (transfert de charge) qui sont amplifiées puis digitalisées. L image est alors construite point par point par balayage (X,Y) à l aide de miroirs de déflexion. La saisie des différents plans se fait par déplacement de la platine motorisée suivant l axe Z.

11 épiderme MB Derme papillaire Peau: fixation d anticorps le long de la basale dans la pemphigoïde bulleuse

12 Pour améliorer la qualité de la localisation, et pouvoir observer le comportement des podocytes sous l influence de drogues variées: culture de podocytes (souris immortalisées). Examen en IF de multiples anticorps colocalisation permise par le microscope confocal laser

13 The Confocal Principle Right Mouse Click to Start Stephen Cody Central Resource Cfor R AdvancedA M Microscopy Ludwig Institute for Cancer Research

14 PMT Fluorescence from the plane-of-focus shines on the detector (PMT) Laser light is reflected from the dichroic mirror and focused on the specimen

15 Only a small amount of light reaches the detector PMT The pihole prevents out-of-focus light reaching the detector The laser will also excite fluorescence from below the plane of focus

16 Again only a small amount of This light reaches the detector PMT The pihole prevents out-of-focus light reaching the detector Similarly the laser will excite fluorescence above the plane of focus

17 PMT Only in-focus light from a small volume within the specimen is imaged

18 PMT If the pinhole is opened the optical section becomes thicker

19 Rôle du pinhole

20 Slit diaphragm glycocalix filaments rara externa lamina densa rara interna Fenêtre de l endothélium

21 néphrine CD2-AP actine

22 Immunolocalisation de la néphrine dans le rein humain normal. Tryggvason, JASN 2003

23 néphrine Actine + néphrine Néphrine, et réseau d actine Actine + néphrine Saleem, Am J Pathol 2002