Diagnostic moléculaire des tumeurs solides, l'expérience Rennaise Bioinformaticien, Biologiste moléculaire, Biostatisticien, Biologiste B. Ndiaye, M. de Tayrac, J. & A. Mosser Le#séquençage#à#haut#débit#NGS#dans#le#cadre#du#diagnos9c##
Probléma9que,#Objec9fs#et#Contraintes# Activité - diagnostic moléculaire des tumeurs solides - oriente la prise en charge thérapeutique Thérapie Non muté Muté Statut EGFR (NSCLC) EGFR-TKI Non répondeur Répondeur Statut KRAS (CCR) Anti-EGFR Répondeur Non répondeur Types d altérations - mutations ponctuelles - petites insertions et petites délétions Matériel biologique - ADN extrait à partir de bloc de paraffine Objectif principal - transfert du diagnostic (pyroséquençage, ARMS, Sanger) en NGS Objectif secondaire - orienter la validation
Probléma9que,#Objec9fs#et#Contraintes# Contraintes Haut-débit Nombre patients (60-80/semaine) Nombre marqueurs (18 gènes) Rapide Délais de rendu de résultat (7 10 jours) Flexible Evolution des thérapies ciblées Econome (INCa) ADN Echantillons précieux (exérèse, biopsie, ponction ) Sensible 5% des prélèvements avec % cells tumorales < 10% Hétérogénéité tumorale FFPE Qualité et quantité d ADN médiocre (20% [dsdna] < 1ng/µl) Accréditation ISO 15189
Technologie#et#Plan#d Expérience# Panel NGS Home-made Panel V1 Hotspot de 17 oncogènes AKT1, ALK, BRAF, CTNNB1, EGFR, ERBB2, FGFR3, HRAS, IDH1, IDH2, KIT, KRAS, MAP2K1, MET, NRAS, PRGFRA, PIK3CA 92 amplicons Taille des amplicons: 116 à 144bp Séquence utile 5,5kb Description des échantillons FFPE samples and Cell line DNA control description Cell line DNA N = 274 7 Cancer Cell Line DNA (4 or 5 replicates) 29 Repeatability 5 pooled cancer cell line DNA (2 replicates per run) - mixture of 5 cancer cell line - 145 Repeatability Reproducibility Traceability Mutations known FFPE Samples N = 2046 Mutations determined by routine technics (pyrosequencing, ARMS or sequencing) 10 mixture of 2 different cancer cell line DNA (2 replicates) (5 dilutions between 3% and 50%) Sample Type NSCLC CRC Melanoma Brain tumor 100 Limit of detection 949 921 124 52 Sensitivity Specificity
Technologie#et#Plan#d Expérience# Production des librairies par une technique «Amplicon» Access Array (Fluidigm) Targets Amplification 48 librairies / 4 hrs LabChip-Gx (Perkin Elmer) Library quantification 96 librairies / 2 hrs Zephyr (Perkin Elmer) Library pooling 96 librairies / 1 hr MiSeq (Illumina) Ultra-deep sequencing 300 cycles / 24 hrs Analyse des résultats par pipeline «Home-made»
Technologie#et#Plan#d Expérience# Amorces# (1#à#10#couples)# Access Array (Fluidigm) ADN# +#mix#pcr#
Technologie#et#Plan#d Expérience# CS1-Tagged TS P5_CS1 CS2-Tagged TS P7_BC_CS2 Pre-amp Ampli Ampli Tagging-a1 P5 CS1 CS2 BC P7 DNA Sequencing Pre-amp Ampli Tagging-a2 Ampli 3 PCR séquentielles Non muté Muté Protocol de production des librairies Non contributif Interprétation
Technologie#et#Plan#d Expérience# QC_RUN Density (K/mm2) Cluster/Reads PF (%) Reads Q > Q30 (%) Go No Go bcl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librairies QC_Amplicons Hot-spots indels Hot-spots snp Valid_technics Nbre reads Qualité des reads (%Q30) % mapping a1_r1 / a1_r2 / a2_r1 / a2_r2 Nbre reads / amplicons Détection et Annotation des insertions & délétions Détection et Annotation des mutations Pour chaque position «HOTSPOT» Nbre reads pour A / T / G & C Qualité phred pour A / T / G & C Go No Go Go No Go Check
Problèmes#Rencontrés# Vierge d expérience - production des librairies - analyses de données NGS Technique - modification du protocole - miniaturisation des volumes Analyse - Outils inadaptés - Ajustement pour garder les insertions et délétions - Dilemme des primers Validation
Réponses#Pra9ques#Apportées# Haut-débit 96 librairies/run Rapide 10jours 2046 Librairies (735 mutations) Flexible 1 mois QC_librairies Econome 70-90 Sensible 3% min 150 copies Sensibilité = 99,22% Spécificité = 99,80% QC_Amplicons FFPE oui Accréditation ISO 15189 Meilleur stratification moléculaire
Réponses#Pra9ques#Apportées# <10% 10% 25% 25 50% >50% NT 0 20 40 60 80 100 AF (%) 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 NGS Allele Frequency (%) PyroSequencing Allele Frequency (%) 0 1000 2000 3000 4000 5000 Nbre reads / amplicon CELL_LINE= xx amplicons Average number of reads BIOPSY_R1 BIOPSY_R2 EXERESE_R1 EXERESE_R2 NON_SOLID_R1 NON_SOLID_R2 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 Q30_depth / prelevement BIOPSY = 686 / EXERESE = 891 / NON_SOLID = 130 Q30_depth
Take#Home#Message# PCR séquentielle pour la robustesse Double indexage des patients pour la spécificité Remise en question de la méthode «amplicon» pour la détection de grande insertion et délétion Production des librairies Importance du dialogue «wet & dry lab» Outils existants insuffisants et/ ou inadaptés à la problématique du diagnostic en somatique Difficulté de nomenclature dans le cadre des indels Analyse des données Difficulté de la validation en l état sur résultats «bruts» en sortie de workflow classique Nécessité d intégrer la validation biologique dans un s y s t è m e o r i e n t é p o u r permettre l accréditation Vers l intégration de métadatas Aide à la validation