Analyses globales et nouveaux indicateurs d exposition dans les cellules de l épiderme humain Laboratoire de Génomique et Radiobiologie de la Kératinopoïèse CEA, Evry
Exposition humaine après diagnostic, radiothérapie accidents Peau poumon système gastrointestinal système hématopoïétique
Peau humaine première cible indicateur épiderme derme tissu adipeux
Irradiation externe. Dosimétrie biologique :. décollement des couches supérieures «stripping» différenciées. peu invasif. possible à plusieurs endroits et plusieurs temps
Modèle : keratinocytes humains primaires,différenciés en culture Technique : puces à ADN pour faire un screening le plus ouvert possible
Tests classiques : un gène, une protéine marqueur Génomique fonctionnelle : puces à ADN ensemble des gènes humains Première application à la dosimétrie biologique : S Amundson, Rad Res, 2000 human lymphocytes
Gene expression DNA Coding sequences: Exon 1 Exon 2 Exon 3 Transcription : DNA ARN Traduction : proteins
chirurgie plastique trypsine kératinocytes normaux primaires calcium, confluence keratinocytes différenciés
Dose : 2 Gy, standard dose dose per fraction / radiotherapy Radiosensitivity 2 Gy induced death in 25 % of cells radioresistant, out of cell cycle
Deux vagues de réponse 6 % des gènes modifiés Inductions 2 Gy Repressions 400 300 Number of genes 200 100 0 3h 6h 15h 24h 48h 72h Hours Post-IR Franco et al., Rad Res, 2005
Quels gènes? 3h : production d énergie Induction of energy producing pathways Induction factor 4 factor 3 2 1 0-1 -2-3 -4-5 Repression factor -6 ATP synthases ATP5C1 ATP5G3 ATP6E Mito respiratory chainglycolysis COX7B HCS PFKP ASNS GUSB AARS COX6B OXA1L PGK1 AHCY IARS GARS Lipid anabolism metabolism Amino acid synthesis Repression of energy consuming pathways
Mesures d ATP intracellulaire kératinocytes différenciés Ratio ATP irradiated 2 vs control cells 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 2 Gy 10 Gy Radiation dose (Gy) 3 h 6 h 24 h Ratio ATP irradiated vs control cells 1,6 1,4 kératinocytes proliférants 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 10 Gy Radiation dose (Gy) ATP: signature précoce et tardive forte dose
Quels gènes? 3h : différenciation Induction of basal markers induction factor 3 2 1 0 ITGA6KRT14 KRT5KRT17 KRT16 CTSD PSG4 PSG7-1 -2 repression factor -3-4 Repression of differentiation markers
Normal epidermis Irradiated epidermis Marqueurs dans la peau humaine? K14 Biopsies irradiées 2 Gy 6 h ATP1a1 Cyt c
Retour au cycle cellulaire 25 20 % S/G2 15 10 0 Gy 2 Gy 5 0 1 h 2 h 3 h 4 h 5 h 24 h Time after irradiation Analyse du cycle cellulaire des cellules HaCaT après marquage à l iodure de propidium Activated phenotype!
Modifications de la chromatine Induction de l histone H1 Normal epidermis 2 Gy 6h
Décompaction de la chromatine FL3 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 [IP] 0 Gy 3h 2 Gy 3h 10gy 3h decompaction at 3h Decompaction transcription activation
Conclusion Kératinocytes différenciés radiorésistants quiescents marqueurs 2 Gy à 3 heures: activation cellulaire production d énergie (ATP) perte de différenciation (kératines, H1) Lamartine J 2004 Franco N 2005
Marqueurs de faibles doses? Réponse des kératinocytes humains différenciés à une très faible dose d irradiation ionisante 10 mgy Une source de 60 Co, 550 KeV Débit de dose : 3 mgy / min Durée de l irradiation : 4 minutes
1ère analyse : déterminer des GENES MARQUEURS des deux doses Irradiation 2 Gy et 10 mgy, témoins 3h 6h 15h 24h 48h 72h RNA (t) Hybridation irradié (t) / non irradié (t) Analyse temps par temps
Réponses dose-spécifiques 10 mcgy 214 269 370 2 Gy 2 Gy : 6 % des sondes, dont 370 spécifiques 10 mgy : 5 % des sondes, dont 214 spécifiques
Analyse temps par temps : profils spécifiques Gènes spécifiques 2 Gy : 3h Gènes communs : 24h et 48h Number of genes 400 300 200 100 0 2 Gy 3h 6h 15h 24h 48h 72h Hours Post-IR Number of genes 500 400 300 200 100 0 10 mgy 3h 6h 15h 24h 48h 72h Gènes spécifiques 10 mgy : 48h Gènes communs : 48h et 72h Hours Post-IR
Qui sont ces gènes? des facteurs de transcription comme PHD finger ou GATA3 PHD finger Exp ression ratio 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 PHF10 1 cgy 3h 6h 48h 72H Microarray qrt-pcr GATA3 Chef d orchestre de la réponse à 10 mgy Franco, 2005 Bonin et al, BMC Genomics 2009 Signature moléculaire faible dose précoce
Qui sont ces gènes? des gènes du stress oxydatif, comme la thioredoxine TXNL 1 cgy 6 Expression ratio 5 4 3 2 1 Microarray qrt-pcr 0 3h 6h 48h 72H Signature moléculaire fd tardive
Qui sont ces gènes? des gènes du catabolisme cellulaire, comme l ubiquitine 2Br UBE2B 1cGy 3 Expression Ratio 2,5 2 1,5 1 0,5 Microarray qrt-pcr 0 3h 6h 48h 72H Signature moléculaire fd tardive
Conclusion kératinocytes différenciés marqueurs 10 mgy précoces: facteurs de transcription stress oxydatif catabolisme Franco N 2005 Bonin F 2009
Organisation hiérarchique de l épiderme humain couche cornée Couche basale cellules souches différenciation terminale prolifération
Cellules souches Cellules differenciées. quiescentes. division asymétrique progéniteurs proliférantes division symétrique MT Martin cours I Curie 2009
Microarrays : 2 Gy response Gene response at 3 hours progenitors 4700 genes Stem/progenitors 227 stem 166 gènes apoptosis DNA repair XRCC5, RAD52, RAD23B, XAB1, BCCIP cell signalling cytokines
Most significant network in irradiated stem cells : apopotosis-inducing genes Ingenuity downregulated genes membrane BAD cytoplasm nucleus
Long-term toxicity: survival at 15 days after 2 Gy progenitors stem cells 12 10 8 6 4 Colony Forming Efficiency CFE nb = de colonies nb cellules ensemencées* * * n = n = 33 p < 0.05 p < 0.05 control irradiated 2 0 TA Sensitive KSC Resistant Stem cells MT Martin PIG 2008
The most significant network of up-regulated genes: cytokines
FGF2 pathway FGF-R1 FGF2 extracellular SHP2 GRB2 H-Ras cytoplasm MEK1 ERK1/2 Radioresistance DNA repair CREB nucleus
Marqueurs 2 Gy Cellules souches et progéniteurs: Cytokines et facteurs de croissance
Applications dosimétriques Liste de gènes spécifiques:. à un état de différenciation. à une dose kits de PCR spécifiques test fonctionnel ATP Puces de pronostic 10 mgy 2 Gy
Génomique fonctionnelle et dosimétrie points forts :. faible quantité de matériel nécessaire ARN de 5000 cellules. reproductibilité des résultats. technique très robuste. génome humain complet l analyse globale est une technique adaptée au screening et diagnostic