La néoplasie de la mye commune (Mya y arenaria) ) http://vre.upei.ca/mhl Julie Pariseau *1,2, Ahmed Siah 2, Maryse Delaporte 2, Stephanie L. Synard 2, Patty McKenna 2, Réjean Tremblay 1, Franck C.J. Berthe 2 Mya arenaria 1: Université du Québec à Rimouski, 310 Allée des Ursulines, Rimouski, Québec 2: University of Prince Edward Island, 550 University Avenue, Charlottetown, PEI ECOBIM 2007 1
Introduction Néoplasies 20 espèces de bivalves Deux principaux types: disséminée et gonadale Une espèce particulièrement susceptible Mye commune: les 2 types sont présents La néoplasie disséminée est une néoplasie hémique En 1999, mortalité massive à l IPE (McGladerry et al. 2001) Jusqu à 95% des individus atteints ECOBIM 2007 2
Aspect fonctionnel des cellules néoplasiques Hémocytes néoplasiques Cellulaire Ont perdu leurs pseudopodes Ratio noyau/cytoplasme Moléculaire 125à205f 1,25 2,05 fois plus d ADN (4N) chromosomes (44-80 au lieu de 26-39) Fonctionnel Ont perdu leurs fonctions Adhésion, phagocytose et défense
Hémocytes N Longueur- 10.9 µm Largeur- 11.8 µm Longueur du noyau- 4.2 µm Ratio N/C: 0.38
Cellules néoplasiques A B N N Longueur- 11.9 µm Largeur- 13µm Longueur noyau- 99 9.9µm Ratio N/C: 0. 83 Longueur- 9.4 µm Largeur- 10µm Longueur noyau- 8.8µm Ratio N/C: 0.93
Méthode de diagnostic Cytométrie en flux Analyse de l hémolymphe Coloration de l ADN avec iodure de propidium normal Échantillon #216 4% 4N 1200 1000 Nb d'hémocyte 800 600 400 200 2N G 0 -G 1 4N S 2N néoplasique 0 0 256 512 768 1024 contenu en ADN Nb d'hémocyte 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 2N Échantillon #1638 4N 60% 4N 0 256 512 768 1024 contenu en ADN 4N 2N
Tétraploïdie et phagocytose 30 25 20 15 % de phagocytose 10 5 0 0,4 0,5 0,5 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1 1 1,2 2 4 4,6 5,7 6 6,7 7,2 10 10 11,8 13,4 17 20 23 26 30 35 47 56 65 71 84 Tétraploïdie ECOBIM 2007 7
Cycle cellulaire Cycle cellulaire G1: croissance 2N S: synthèse de l ADN G2: croissance 4N M: mitose Point clé, sous contrôle p53 Permet le bon fonctionnement cellulaire p53 p53 ECOBIM 2007 8
Dommage à l ADN Membrane cellulaire Séquestration cytoplasmique de la p53 Mutation du gène et protéine p53 (Walker et al 2006) (Barker et al 1997) X Noyau ADN Mortaline Arrêt du Cycle cellulaire Apoptose Ribosome
Mutation de la p53 chez la mye commune Selon Barker et al. 1997 Mutation de type transversion pour le gène Au niveau de l exon 6 (site non fonctionnel) Substitution d une cytosine par une guanine Proline au lieu de l alanine 2 échantillons ont la mutation sur 11 Mutation de la protéine Par technique d immunofluorescence (IFAT) Anticorps monoclonal PAb 240 Mutation ti entre les acides aminés 213-217217 5 individus ont montré la mutation sur 11 ECOBIM 2007 10
Expression et mutation du gène 30 myes (5%-80%) HaeIII TaqI p53 RT-PCR (Expression) Hémocytes RFLP (Mutation) Enzymes de restriction SSCP? Hae III, Taq I 421 386 292 264 150 126 ECOBIM 2007 11
Expression de la protéine Mise au point de la technique Western blotting Conditions dénaturantes PAb 240 (type sauvage et muté de p53) HCC 70 53 150 100 75 HCC 70 Hémocyte Mye Western blotting (4 myes exprimant + +++ ++ ++ HCC70 Marqueur niveau du gène p53 par Q-RT- PCR) Conditions dénaturantes 53 Branchies PAb 421 (type sauvage p53) HCC 70
Séquestration de la p53 (Walker et al. 2006) in/18s Relative expression Mortal 35 30 25 20 15 10 5 Mort=0.5p53+0.764 R 2 =0.498 RELAT TIVE EXPRESS SION 40 30 20 10 0 p53/18s p73/18s Mort/18S 0 0 10 20 30 40 0-5 5-15 15-50 50-90 Relative expression p53/18s % TETRAPLOIDY
Identification des acteurs moléculaires l associés à la néoplasie hémique chez Mya arenaria ECOBIM 2007 14
Principe de comparaison du transcriptome Normal Malade Transcrit Down-régulés Transcrit Non-régulés Transcrit Up-régulés
«Subtractive PCR Suppression Hybridization» Adaptator 1 Tester Adaptator 2 Ligation Driver Hybridization Hybridization Tester-Tester Heterodimers PCR Primer Tester-Driver Heterodimers Amplification Driver ds/ss Tester ss No Amplification Tester-Tester Homodimers Hairpin Structure Amplification Cloning/Sequencing/Bioinformatic g Analysis
Subtractive Suppression Hybridization RELA ATIVE EXPRE ESSION 40 30 p53/18s p73/18s Mort/18S P2 20 P1 P3 10 0 0-5 5-15 15-50 50-90 % TETRAPLOIDY ECOBIM 2007 17
Branched DNA Système de quantification d expression du gène sur microplaque (simplex) Capture Extender Probe Label Extender Probe Blocking Probe
Système de quantification d expression du gène sur billes (Multiplex)
Perspectives Néoplasie Vibrio spp. SSH SSH Gènes impliqués Gènes impliqués N V
Remerciements ECOBIM 2007 21