Q PCR sur LC480 Roche

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1 Q PCR sur LC480 Roche!! NE JAMAIS LAISSER DE PLAQUE DANS L APPAREIL!! Généralités : lampe xénon à arc : s éteint 30 min après chaque run durée d un run : plq 96p = 1h10 environ plq 384p = min environ Mise en route de l appareil : allumer (interrupteur côté droit) attendre que la diode arrête de clignoter et passe au vert (la 2 ème diode reste rouge si l appareil est vide) bouton bleu pour ouvrir le tiroir disposer la plaque : côté biseauté du portoir correspond au côté biseauté de la plq 96 puits rappuyer sur la flèche pour fermer. La 2 ème diode passe au vert ouvrir le logiciel : codes Windows : login : LCinstall password : LCinstall codes logiciel : login : ircm password : Ircm34 new experiment : from Template (des «run Template» sont enregistrés pour le programme de base en 96p et 384p) SAMPLE EDITOR : (feuille d échantillons = plan de plaque) Rq : les copier / coller fonctionnent multisélection : ctrl + sélectionner les puits possible d enregistrer 1 «sample list Template» à rappeler si le plan de la plaque est toujours le même et que seuls les gènes à quantifier changent : utiliser les boutons import / export il est possible de renseigner toutes les infos qui vont suivre MIS A PART LES CYCLES DU RUN après le run sélectionner la méthode de quantification pour rentrer le plan de plaque : sélectionner les puits en multisélection en step 2 step 3 : qualifier les puits (voir ci dessous) si on fait de la relative quantitation : placer gène cible et gène réf en face sur le plan de plaque pour que le logiciel puisse faire du pairing (sinon possible de le faire manuellement) make replicates : sélectionner les puits concernés puis cliquer sur «auto replicates» (colonne «Repl. of») colonne «sample name» : nom de l échantillon

2 colonne «target name» : cible = nom du gène / réf = nom du gène / calibrateur = nom du gène «sample type» : unknown = gène à quantifier calibrator = gène calibrateur stat = rentrer la concentration (en valeurs arbitraires si on fait de la quantification relative ctrl négatif = NTC (contrôle sans ADN) SUBSET EDITOR : (organisation de la plaque : important pour faire de la quantification automatique) Rq : pas besoin de le remplir si on fait des exports directs des Cp (comme dans Applied) créer les subset : 1 subset = 1 gène «new» en bas à gauche rentrer le nom sélectionner les puits correspondants apply en bas à droite pour une gamme : sélectionner «target standard» pour chaque échantillon dans le sample editor rentrer dans la colonne stat la concentration relative : pour une gamme au ½ allant de la RT brute, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 rentrer 100, 50, 25, 12,5, 6,25 créer les Subset : attention! pour analyser 3 droites de gammes indépendamment il faut créer 3 subsets sinon le logiciel fait automatiquement la moyenne des 3 gammes RUN PROTOCOL : format détection : sybr green I reaction volume : 10 l enregistrer le run dans le dossier «experiment» en bas à droite : «start run» (il n est possible de démarrer que si on a mis une plaque dans le portoir) onglet DATA s ouvre automatiquement en haut à côté de l onglet run protocol dans fluorescence history : dans Axis, choisir fluorescence over cycles pour visualiser les courbes d amplification en fonction du nombre de cycles

3 Programme standard : dénaturation : 95 C 10min 1 cycle no acquisition mode dénaturation : 95 C 15 sec acquisition mode = none annealing : 60 C 10 sec acquisition mode = Quantification sur none extension : 72 C 15 sec acquisition mode = 40 cycles single + courbes de fusion : 1 cycle melting curves 95 C 10 sec 70 C 30 sec 95 C acquisition mode = continuous (5 acquisitions / degré) + refroidissement : 40 C 30 sec Mix QPCR sybr green plaques 96 puits: Préparer chaque primer à 100 M puis faire un mélange v/v pour avoir 50 M Master mix H 2 O Primer mix 50 pmol/ l ADN (1 à 5 ng/ l) ou RT (dilution au 1/15 ème d 1 RT de 1 ug dans 20ul) 5 ul 2,9 l 2 l 10 l Distribuer 8 l 0,1 l Mix QPCR sybr green plaques 384 puits: Il est possible d utiliser un volume réactionnel de 10 ul ou de diminuer jusqu à 5 ul (5ul de mix + 2 ul de matrice/puits)

4 ANALYSIS : quand le run est terminé : créer une analyse = 1 succession de plusieurs items!!! CLIQUER SUR SAVE A CHAQUE FOIS QUE L ON TERMINE UNE ETAPE!!! cliquer sur le + en haut à droite pour ajouter une analyse Rq : idéalement les Cp doivent sortir entre 20 et 30 cycles pour avoir une quantification robuste analyse 1 : Tm calling = courbes de fusion tout analyser d un bloc ou sélectionner le subset cliquer sur calculate dans hybe probe format choisir : sybr green I format Rq : avec clic droit, export possible de chaque fenêtre de l écran analyse 2 : effectuer les quantifications Rq : toujours analyser les gammes et les échantillons avec la même méthode! 1/.ABSOLUTE QUANTIFICATION : d 1 manière générale, choisir 2 nde dérivative max, à condition que la phase plateau soit bien atteinte pour tout le monde si on choisit le Fit point (positionnement manuel du seuil) : positionner le seuil le plus bas possible près du bruit de fond puis cliquer sur calculate puis onglet analysis. Cette méthode n est meilleure que si on a des différences au niveau des plateaux des courbes d amplification. 2/.RELATIVE QUANTIFICATION : choisir la méthode «Advanced relative quantification» parce que c est celle qui effectue les calculs relatifs au plus juste en tenant compte des paramètres de la gamme pour un couple de primer donné. Pour appliquer la méthode des Ct mieux vaut avoir target gene/reference/calibrateur sur la même plaque (mais il est possible d aller chercher la ref sur une autre plaque) Concentration ratio = Ct Normalized ration = Ct Pairing rules : (p.191 du guide) target unknown et reference unknown sont obligatoires et le gène différent mais pour l autopairing, le sample name doit être identique calibrator et standards sont facultatifs All to all = tous les gènes cibles / tous les gènes de réf All to mean = tous les gènes cibles / moyenne des gènes de réf Mean to all = ne sert pas One to one = ne sert pas La méthode de calcul automatique par le logiciel n est intéressante que si on fait des études «classiques» d expression 3/.ANALYSE D UNE GAMME : que ce soit en Abs quant ou en Rel quant : vérifier les paramètres de la droite de régression tracée à partir de la gamme : efficacité maximum = 2 error = plus elle est proche de zéro, mieux c est (0,00.. est très bon comme erreur) c est un critère discriminant slope = 3,31 si l efficacité du couple de primers est maximale

5 intercept = équivalent de l ordonnée à l origine (idéalement, il faut comparer des gènes qui présentent un intercept du même ordre, cela signifie que l on compare des intensités d expression du même ordre Tm = température de fusion spécifique de chaque couple erreur sur les réplicats = plus elle est proche de zéro mieux c est Si on veut pouvoir rappeler la gamme pour des calculs, enregistrer la gamme comme gamme externe : sélectionner «standard curve in run» en bas à droite Save as external Sauvegarde de la gamme par le nom du gène : attention!!! si on veut rappeler cette gamme, il faut que le target name (nom du gène) soit écrit de manière identique à celle de la sauvegarde de la gamme (respecter la casse) 4/.ANALYSE D UN RUN et QUANTIFICATION RELATIVE : soit en systématique soit exporter les Cp et appliquer la formule suivante : quantité = 2 cp (si on considère que l efficacité du couple de primers est maximale) quantité = 10 puissance((intercept Cp)/slope) EXPORT DES RESULTATS : il faut d abord sauver les analyses pour exporter un tableau de résultats avec les Cps : se placer dans l onglet «report» cocher results clic droit sur le tableau de résultats tableau exporté mais rajouter le nom du gène comme nom du fichier car il n est pas exporté à effectuer subset / subset OU se mettre dans la fenêtre «samples» Clic droit sur le tableau Export tables pour générer un pdf : se placer sur l onglet «report» choisir les items que l on veut imprimer pour exporter une manip : aller dans la boussole soit batch export (pour un dossier) soit manip par manip idem pour importer