Transcription

1 La néoplasie de la mye commune (Mya y arenaria) ) Julie Pariseau *1,2, Ahmed Siah 2, Maryse Delaporte 2, Stephanie L. Synard 2, Patty McKenna 2, Réjean Tremblay 1, Franck C.J. Berthe 2 Mya arenaria 1: Université du Québec à Rimouski, 310 Allée des Ursulines, Rimouski, Québec 2: University of Prince Edward Island, 550 University Avenue, Charlottetown, PEI ECOBIM

2 Introduction Néoplasies 20 espèces de bivalves Deux principaux types: disséminée et gonadale Une espèce particulièrement susceptible Mye commune: les 2 types sont présents La néoplasie disséminée est une néoplasie hémique En 1999, mortalité massive à l IPE (McGladerry et al. 2001) Jusqu à 95% des individus atteints ECOBIM

3 Aspect fonctionnel des cellules néoplasiques Hémocytes néoplasiques Cellulaire Ont perdu leurs pseudopodes Ratio noyau/cytoplasme Moléculaire 125à205f 1,25 2,05 fois plus d ADN (4N) chromosomes (44-80 au lieu de 26-39) Fonctionnel Ont perdu leurs fonctions Adhésion, phagocytose et défense

4 Hémocytes N Longueur µm Largeur µm Longueur du noyau- 4.2 µm Ratio N/C: 0.38

5 Cellules néoplasiques A B N N Longueur µm Largeur- 13µm Longueur noyau µm Ratio N/C: Longueur- 9.4 µm Largeur- 10µm Longueur noyau- 8.8µm Ratio N/C: 0.93

6 Méthode de diagnostic Cytométrie en flux Analyse de l hémolymphe Coloration de l ADN avec iodure de propidium normal Échantillon #216 4% 4N Nb d'hémocyte N G 0 -G 1 4N S 2N néoplasique contenu en ADN Nb d'hémocyte N Échantillon #1638 4N 60% 4N contenu en ADN 4N 2N

7 Tétraploïdie et phagocytose % de phagocytose ,4 0,5 0,5 0,5 0,6 0,7 0,8 0, , ,6 5,7 6 6,7 7, ,8 13, Tétraploïdie ECOBIM

8 Cycle cellulaire Cycle cellulaire G1: croissance 2N S: synthèse de l ADN G2: croissance 4N M: mitose Point clé, sous contrôle p53 Permet le bon fonctionnement cellulaire p53 p53 ECOBIM

9 Dommage à l ADN Membrane cellulaire Séquestration cytoplasmique de la p53 Mutation du gène et protéine p53 (Walker et al 2006) (Barker et al 1997) X Noyau ADN Mortaline Arrêt du Cycle cellulaire Apoptose Ribosome

10 Mutation de la p53 chez la mye commune Selon Barker et al Mutation de type transversion pour le gène Au niveau de l exon 6 (site non fonctionnel) Substitution d une cytosine par une guanine Proline au lieu de l alanine 2 échantillons ont la mutation sur 11 Mutation de la protéine Par technique d immunofluorescence (IFAT) Anticorps monoclonal PAb 240 Mutation ti entre les acides aminés individus ont montré la mutation sur 11 ECOBIM

11 Expression et mutation du gène 30 myes (5%-80%) HaeIII TaqI p53 RT-PCR (Expression) Hémocytes RFLP (Mutation) Enzymes de restriction SSCP? Hae III, Taq I ECOBIM

12 Expression de la protéine Mise au point de la technique Western blotting Conditions dénaturantes PAb 240 (type sauvage et muté de p53) HCC HCC 70 Hémocyte Mye Western blotting (4 myes exprimant HCC70 Marqueur niveau du gène p53 par Q-RT- PCR) Conditions dénaturantes 53 Branchies PAb 421 (type sauvage p53) HCC 70

13 Séquestration de la p53 (Walker et al. 2006) in/18s Relative expression Mortal Mort=0.5p R 2 =0.498 RELAT TIVE EXPRESS SION p53/18s p73/18s Mort/18S Relative expression p53/18s % TETRAPLOIDY

14 Identification des acteurs moléculaires l associés à la néoplasie hémique chez Mya arenaria ECOBIM

15 Principe de comparaison du transcriptome Normal Malade Transcrit Down-régulés Transcrit Non-régulés Transcrit Up-régulés

16 «Subtractive PCR Suppression Hybridization» Adaptator 1 Tester Adaptator 2 Ligation Driver Hybridization Hybridization Tester-Tester Heterodimers PCR Primer Tester-Driver Heterodimers Amplification Driver ds/ss Tester ss No Amplification Tester-Tester Homodimers Hairpin Structure Amplification Cloning/Sequencing/Bioinformatic g Analysis

17 Subtractive Suppression Hybridization RELA ATIVE EXPRE ESSION p53/18s p73/18s Mort/18S P2 20 P1 P % TETRAPLOIDY ECOBIM

18 Branched DNA Système de quantification d expression du gène sur microplaque (simplex) Capture Extender Probe Label Extender Probe Blocking Probe

19 Système de quantification d expression du gène sur billes (Multiplex)

20 Perspectives Néoplasie Vibrio spp. SSH SSH Gènes impliqués Gènes impliqués N V

21 Remerciements ECOBIM