Docteur Serge BOTTARI

Transcription

2 Le Monoxyde d Azote NO Produit par les NO synthases (NOS): nnos (NOS I) and enos (NOS III) Exprimées de façon constitutive Activées par [Ca ++ ] i Produisent des concentrations nanomolaires de NO inos (NOS II) Exprimée de façon constitutive à de faibles concentrations et inductible (cytokines, ) Activité: constitutive mais stimulable par les RCPG par l intermédiaire de G βγ Produit des concentrations micromolaires de NO

3 Régulation et activité des NO synthases RCPG RTK Ca i ++ enos nnos Arg NO [nm] solgc cgmp Nitrosylation (Cys-NO) Expression inos Arg NO [µm] O 2 NO + ONOO - G βγ O 2.- RCPG NAD(P)Hoxidases Nitration (Tyr-NO 2 )

4 Propriétés du NO Gaz Radical libre peu réactif Concentrations in vivo: 5 nm - 4 µm Très diffusible (1,4 x > O 2 ): 100 µm en quelques secondes Tamponné par les globules rouges: réagit avec l oxyhémoglobine, donnant du nitrite (NO 2- ) et de l Hb nitrosylée L Hb nitrosylée peut relarguer du NO +, radical très réactif.

5 La [NO] détermine ses effets Faibles concentrations: Résultant de l activation de enos et nnos Cibles: Facteurs de transcription: p. ex. HIF-1 Enzymes: heme oxygénase synthèse de l hème, cofacteur des NOS synthèse de NOS cytochrome c oxydase de la synthèse d ATP catalase d OH. chez les macrophages Guanylate cyclase soluble

6 Voies de signalisation du NO en fonction de sa concentration

7 La guanylate cyclase soluble Responsable de la majorité des effets connus du NO Activité stimulée 400 X par le NO Produit du GMPc à partir de GTP Cibles: Protéine kinases G (PKG) Canaux nucléotides cycliques dépendant Protéine kinase A (PKA) Phosphodiestérases

8 Protéine kinase G I Sérine-thréonine kinase Cytosolique Muscle lisse, cervelet, plaquettes Récepteur IP 3 : relaxation du muscle lisse Récepteur Thromboxane A2 : agrégation plaquettaire Phosphatase de la chaine légère de la myosine : relaxation du muscle lisse Applications (donneurs de NO ): Angine de poitrine Hypertension pulmonaire du nouveau-né Prééclampsie

9 Protéine kinase G II Sérine-thréonine kinase Membranaire Ubiquitaire, pas dans le SCV CFTR (canal Cl) : diarrhée Applications:?

10 Autres cibles du GMPc Canaux nucléotides cycliques dépendants: Canaux cationiques de la rétine: Vision des couleurs PKA: Cross-talk entre voies activées par l AMPc et le GMPc Phosphodiestérases (PDE): Dégradent le GMPc et l AMPc Rétine: Transduction du signal photonique Vaisseaux: Viagra: inhibiteur sélectif de la PDE 5

11 Effets du NO à fortes concentrations Effets à des concentrations > 1 µm Dus à l activation d inos Inflammation, infections, ischémie, hypoxie, diabète, Production de radicaux libres résultant de l oxydation du NO: NO + (nitrosonium) ONOO - (peroxynitrite) Modifications covalentes de l ADN de protéines: nitrosylation et nitration Peroxydation: Lipides

12 Auto-oxydation du NO: nitrosonium et nitrosylation des cystéines

13 Réaction du NO avec O 2.- : peroxynitrite et nitration des tyrosines

14 Le NO produit par enos et nnos n est pas oxydé en NO + ni en ONOO - enos nnos Arg NO [nm] NO 2-, NO 3 - inos Arg NO [µm] O 2 NO + ONOO - O.- 2

15 Ischemie-reperfusion: production de radicaux libres

16 Signalisation du NO en fonction de sa concentration

17 Ions superoxyde (O 2.- ): Produits par: transport mitochondrial d e - NAD(P)H-oxidases (Nox) xanthine oxidase inos Toxicity: Peroxidation des lipides (e.a. de la membrane mitochondriale) perméabilisation fuites apoptose Altérations de l ADN Oxidation des protéines Formation de peroxynitrite (ONOO - ) en présence de concentrations µm de NO (inos)

18 Protéines plasmatiques nitrées révélées par un anticorps anti-nitrotyrosine et électrophorèse

19 Protéines plasmatiques nitrées identifiées Albumine ( transport transendothélial Fibrinogène ( polymérisation) Plasminogène ( conversion en plasmine) Transferrine (?) Céruloplasmine ( activité ferroxidase) Inhibiteur de l α 1 -protéase ( activité) α 1 -antichymotrypsine (activité =)

20 Protéines cellulaires nitrées PGI2 synthase ( ) PGH synthase ( ) SERCA 2A ( ) PKCε ( ) Calmoduline ( ) connues Contractilité du muscle lisse et myocardique Mn SOD ( ) Ribonucl. réductase ( ) Bax ( ) Récepteurs NMDA ( ) GlutathionS transférase ( ) α Synucléine, tubuline agrégation Récepteur de l EGF ( ) MEK 1/2 ( ) ERK 1/2 ( ) IRS-1 ( ) PPARγ ( ) PKB/Akt ( ) PI3-kinase ( ) Apoptose Prolifération Sensibilité à l Insuline

21 La nitration comme mécanisme de signalisation Exemple: Rôle dans l activation des MAP kinases

22 Mécanisme classique d activation des MAP kinases ERK1/2 par l Ang II AT 1 Ang II MEK Raf ERK1/2 G αq/11 P-MEK PLCβ PKC Ras PP-ERK1/2 MKP s Ang II AT 2 SHP-1 ERK1/2

23 Rôle de la nitration dans l activation d ERK 1/2 par l Ang II MEK-NO 2 G inos NO ONOO - ERK1/2-NO 2 1 AT 1 2 PLD Nox O._ 2 P-MEK-NO 2 PP-ERK1/2-NO Raf 2 G αq PLCβ PKC Ras Deux voies sont requises: 1 nitration 2 phosphorylation Cyclins D, p90 rsk, myc, elk,

24 Insulin signaling Glucose uptake GLUT4 Sodium transport enac PI3-K IRS 1/2 InsR Shc Jnk PKC PDK1/2 ERK 1/2 mtor PKB/Akt Bad Apoptosis Proliferation p70 S6K, elfs GSK-3 PKA Protein synth. Fatty acid + Glycogen synth. Lipolysis

25 Insulin resistance Glucose uptake Sodium transport InsR GLUT4 enac PI3-K IRS 1/2 Shc P-Jnk PKC PDK1/2 PP-ERK 1/2 mtor PKB/Akt Bad Apoptosis Proliferation p70 S6K, elfs Protein synth. GSK-3 Fatty acid + Glycogen synth. PKA Lipolysis Angiopathy, Nephropathy, Retinopathy,

26 Ang II and insulin resistance Glucose uptake Sodium transport InsR GLUT4 enac PI3-K IRS 1?? Shc MEK Jnk PKC PDK1/2? Ang II ERK 1/2 mtor PKB/Akt Bad Apoptosis Proliferation p70 S6K, elfs GSK-3 PKA Protein synth. Fatty acid + Glycogen synth. Lipolysis

27 Nitration et insulinorésistance Captation du glucose GLUT4 Transport du sodium enac PI3-K IRS 1 InsR Shc MEK Jnk PKC PDK1/2 ONOO - ERK 1/2 mtor PKB/Akt Bad Apoptosis Prolifération p70 S6K, elfs GSK-3 PKA Synth. protéique Synth. Acides gras + Glycogène Lipolyse

28 Régulation d Akt par l insuline et l Ang II Insuline L-arg PI3-K enos L-cit GC NO NO [nm] NO 2 PO 4 PO 4 PKGa PKGi GCa NO 2 p-erk 1/2 Akt GMPc ONOO - GTP PO 4 PO 4 NO 2 inos L-cit NO + O 2.- NO [µm] L-arg Nox Ang II L insuline active Akt par phosphorylation par l intermédiaire de la PI3-K et de la PKG. L Ang II active ERK par nitration et phosphorylation. ERK inhibe la phosphorylation d Akt et donc son activation par l insuline. L Ang II induit également la nitration d Akt.

29 Conclusion La nitration constitue un mécanisme de signalisation au même titre que d autres modifications post-traductionnelles telles la phosphorylation.

30 L albumine plasmatique nitrée comme marqueur du stress nitrant

31 L albumine nitrée Nitration sélective des Tyr 138 et Tyr 411 Tyr 138 : Sous-domaine IB: site de liaison d hydrocarbures aromatiques polycycliques Tyr 411 : Sous-domaine IIIA: site catalytique de l activité esterase et site de liaison majeur de diverses drogues Transport transendothelial augmenté de 2 à 4 fois suite à nitration

32 Augmentation de l albumine nitrée chez les nouveaux-nés présentant une hypoglycémie Groupe 1: hypoglycémie sévère: glycémie< 25 mg/dl (< 2,5 mmol/l), (n=6) Groupe 2: hypoglycémie modérée: glycémie mg/dl (1,4-2,4 mmol/l), (n=15) Groupe 3 : normoglycémie: glycémie 45 mg/dl ( 2,5 mmol/l), (n=30) 20 p< 0.05 NO2-Albumin (ng/ml) NO 2 -Albumin (ng/ml) Sang artériel (30-60 de vie)

33 Augmentation de l albumine nitrée chez les nouveaux-nés asphyxiés Evolution normale (0) ou Encéphalopathie légère (1) : n= 14 Encéphalopathie modérée (2) à sévère (3) : n= 7 NO2-Albumin (ng/ml) Day 1 NO 2 -Albumin (ng/ml) NE 0-1 NE 2-3 Sang veineux (J1) p< 0.05

34 L albumine plasmatique nitrée Augmente dans des situations entraînant un stress oxydatif Elle indique l existence d un stress nitrant dans l hypoxie et l hypoglycémie chez le nouveau-né Utilisable en tant que marqueur biologique du stress nitrant chez l Homme

35 Pathologies accompagnées d une augmentation de la nitration Maladies inflammatoires Maladies infectieuses Maladies neurodégénératives Parkinson, Alzheimer, sclérose en plaques, Creutzfeldt-Jacob, Maladies ischémiques: Maladie coronarienne, infarctus vasculaires cérébraux, du myocarde, accidents Hypoxie Diabète: types 1 et 2

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